摘要：合作作者：Xinyong Shi (史新勇)；Jialin Wu (吴家林)；Ziang Zhou (周子昂)；Yawen Tang (汤雅文)；Zhen Bao (鲍真)；Nan Luo (罗楠)；Jiong Chen (陈炯)

Water Research: 宁波大学张化俊/张德民组揭示含氯消毒剂消毒海水后原核群落的恢复机制

宏基因组测序揭示消毒后海水原核群落恢复机制及对抗生素抗性基因传播的影响

Metagenomic insights into the rapid recovery mechanisms of prokaryotic community and spread of antibiotic resistance genes after seawater disinfection

Article，2024-12-04

Water Research, [IF 11.4]

DOI：https://doi.org/10.1016/j.watres.2024.122887

第一作者：JiaoJiao Yan (闫娇娇)；Xinxu Zhang (张新旭)

通讯作者：Demin Zhang (张德民)；Huajun Zhang (张化俊)

合作作者：Xinyong Shi (史新勇)；Jialin Wu (吴家林)；Ziang Zhou (周子昂)；Yawen Tang (汤雅文)；Zhen Bao (鲍真)；Nan Luo (罗楠)；Jiong Chen (陈炯)

主要单位：

宁波大学农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室 (State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Ningbo University, Ningbo, 315211, China)

宁波大学东海战略研究院 (Marine Economic Research Center, Donghai Academy, Ningbo University, Ningbo, 315211, China)

深圳大学(Archaeal Biology Center, Synthetic Biology Research Center, Shenzhen Key Laboratory of Marine Microbiome Engineering, Key Laboratory of Marine Microbiome Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, Institute for Advanced Study, Shenzhen University, Shenzhen, 518060, China)

上海承葛生物技术有限公司(Shanghai Treatgut Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, 200441, China)

宁波大学海洋学院(Key Laboratory of Aquacultural Biotechnology, Ministry of Education, School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo, 315211, China)

宁波海微生态科技有限公司(Ningbo Haiwei Ecological Technology Co., Ltd., Ningbo, 315141, China)

摘要

Abstract

含氯消毒剂，如漂白粉，被广泛应用于水产养殖的源水消毒管控，以控制细菌等病原菌并消除抗生素抗性基因（ARGs）。然而，消毒后原核生物群落组成（PCCs）的快速恢复可能会显著影响消毒的总体效果。目前，关于PCCs的快速恢复机制及其对海水中ARGs去除的影响尚未见报道。本研究针对水产养殖的消毒过程，利用16S rRNA基因扩增子和宏基因组测序技术，对上述问题进行了深入研究。结果表明，PCCs的恢复在消毒16 h后即开始，至72 h恢复至与对照类似组成。PCCs快速恢复的机制是消毒后微生物间的协同互作增强和消毒抗性细菌（DRB）的存在所致。与外排泵相关的消毒抗性基因（DRGs）是支持DRB抵抗消毒的主要分子机制。在78种注释到的ARGs中，只有10种ARGs在消毒72 h后显著下降（P

引言

Introduction

水产养殖病害频发，为养殖业带来了巨大的经济损失，进行海水消毒是控制潜在病原，确保养殖顺利开展的必要措施。含氯消毒剂（如漂白粉）的消毒是水处理系统中常见的水质安全管控措施，用以控制水中的病原菌和去除抗生素耐药基因（antibiotic resistance genes, ARGs）等风险因子。在我们之前的研究中（Tang et al., Water Research, 2023），发现使用漂白粉消毒海水后虽然30 min内漂白粉具有极强的杀灭作用，但消毒16 h后，细菌群落能够迅速恢复；然而，导致微生物群落快速恢复的机制仍不清楚。本研究中，我们利用生产中常用漂白粉浓度100pm于对虾帆布池系统中进行海水消毒（图1A），通过宏基因组测序，全面探讨了消毒后细菌群落的共现模式及抗生素抗性基因（ARGs）、消毒抗性细菌（DRB）与消毒抗性基因（DRGs）之间的相互作用，揭示：（1）消毒后原核生物群落的恢复模式及DRB对群落恢复的作用；（2）微生物间相互作用对原核生物群落恢复的贡献；（3）阐明DRGs、ARGs和DRB之间的关系，以及它们在原核生物群落恢复中的作用。本研究结果将为制定合理高效的海水消毒管控措施，解决消毒对ARGs传播的影响等公共卫生问题提供重要依据。

结果

Results

消毒后原核群落变化及恢复特征

Rapid recovery of prokaryotic community compositions

消毒后，原核群落组成在0.5 h内迅速改变，并于16 h后开始恢复（图1B）。对照组中，α-变形菌的平均相对丰度为34.07%；消毒0.5 h后，α-变形菌的相对丰度显著降低，至16h时相对丰度为1.37%-7.24%；随后开始恢复，在消毒后24 h-168 h的平均相对丰度为56.67%。γ-变形菌则呈现相反的趋势，从消毒后0.5 h开始，相对丰度急剧上升，至16 h达到94.54%，随后逐渐恢复，至72h时与CK组接近。科水平上，原核群落生消主要由Rhodobacteraceae的再生和Pseudoalteromonadaceae的衰退所主导。NMDS分析发现（图1C，D），消毒后原核群落结构差异显著，且表现出显著的恢复特征。

图1. 消毒后原核群落组成和结构变化

A：实验设计。红色时间点为宏基因组测序样品。B：原核群落组成变化。C-D：原核群落结构（基于扩增子测序）和功能结构（基于宏基因组）变化。CK：对照组；DST：消毒组。

消毒后原核群落的互作关系

Co-occurrence patterns of prokaryotic community after disinfection

网络分析发现，CK组共现网络的节点和边的数量从16 h内的98个（183条边）增加到72 h的285个（984条边）。与CK组相比，DST组在16 h内的共现网络具有最大的节点数（556个）和边数（2557条），是所有网络中最复杂的互作网络，而且原核生物间的互作主要是正相关作用。然而， DST组的网络在16 h-72 h的恢复过程中表现出简化的趋势，72 h后其网络拓扑参数与CK组网络接近，表明消毒72 h后微生物间的互作恢复至与对照类似水平。综上，消毒后但在群落恢复前（16 h内），水体原核生物间互作增强且主要为正相互作用，说明原核生物可通过增加协同互作来共同抵抗消毒的高压环境（类似“抱团取暖”），当余氯消解后环境压力减弱，原核间的互作强度下降并恢复至对照水平。

图2. 原核生物间互作关系

A-B：CK组16 h内（A）和24 h-72 h（B）的共现网络。C-D：DST组16 h内（C）和24 h-72 h（D）的共现网络。E：各网络物种的节点数。F-G：分别为CK组和DST组各物种比例。节点颜色按门水平着色；边的红色和绿色分别代表正相关和负相关。CK：对照组；DST：消毒组。

原核生物宏基因组分箱结果

Overview of compositions and characteristics of MAGs

宏基因组分箱得到168个MAGs，包括166个细菌和2个古菌。细菌MAGs主要包括α-变形菌（45个MAGs）和γ-变形菌（40个MAGs）。在30个最高丰度的MAGs中，Bin73（Pseudomonas khazarica）在16 h内的DST组中具有最高的丰度（平均相对丰度为5.60%），表明其对消毒具有较强的抗性（图3）；Bin160（Pseudomaricurvus albida，2.48%）和Bin15（Stutzerimonas chloritidismutans，1.67%）在DST组的16 h也有较高的丰度。在72 h时，Bin21（UBA1280，15.85%）、Bin143（Kordiimonas，9.04%）和Bin110（Leisingera，2.59%）是DST组中主要的MAGs。

图3. 166个细菌MAGs的系统发育分析

30个丰度最高的MAGs用黑点标记；> 90%的Bootstrap值以浅蓝色显示

消毒对环境中ARGs和DRGs的影响

Impacts of disinfection on the relative abundances of ARGs, DRGs and their hosts

经与CARD数据库比对，共鉴定到78个ARGs（图4）。消毒后72 h，只有10个ARGs的丰度显著下降（P

图4. ARGs和DRGs对消毒的响应

A: 消毒后72 h显著变化的ARGs（上）和DRGs（下）。B：ARGs（上）和DRGs（下）与微生物的共现网络。C：ARGs（左）和DRGs（右）在网络中的节点数量

消毒后环境中DRGs、ARGs和细菌三者间的关系

Relationships between DRGs and ARGs

在相对丰度最高的30个MAGs中富集的DRGs主要与外排泵、EPS和氧化应激系统有关（图5）。在红杆菌科、交替单胞菌科、Kordiimonadaceae和假单胞菌科的细菌中，DRGs的丰度，特别是acrR、tolC、coxB、gspG、hemN和msrA基因的丰度较高（图5A）。另外，在Bin73（P. khazarica）中，外排泵系统中的acrR、oprM和tolC基因显著富集，这些基因的高丰度或保证了该菌的高消毒抗性。基于Spearman相关性分析发现，消毒后72 h 的ARGs与具有显著差异的DRGs之间有显著的相关性，包括5个大环内酯类、6个氟喹诺酮类、5个β-内酰胺类和3个二氨基嘧啶类ARGs，在消毒后与几乎所有类型的DRGs都表现出明显的正相关性；这些DRGs主要属于细胞膜通透性、外排泵系统和胞外聚合物分泌系统相关基因（图5B）。桑基图分析发现，源自6个细菌科的DRGs促进了ARGs在消毒后的传播，包括红杆菌科（11.66%）、玫瑰杆菌科（9.58%）、交替单胞菌科（3.75%）、海洋螺菌科（2.82%）、纤维弧菌科（2.66%）和染色菌科（2.44%）（图5C）。

图5. 细菌、ARGs和DRGs三者间的关系

A：丰度最高的30个MAGs中的DRGs。B：ARGs和DRGs间的Spearman相关性。C：Sankey分析消毒后细菌通过何种DRGs促进主要ARGs的传播。

高抗消毒细菌的抗消毒机制

Resistance mechanisms of bacteria to disinfection

在消毒后16 h内，Bin73（P. khazarica）和Bin15（S. chloritidismutans）的相对丰度显著增加（图3）；由于此时处于高氯环境，因此我们认为这两株菌是高抗消毒细菌。宏基因组分箱获得了两株菌的高质量基因组（完整度高于90%且污染度低于3%）。两个MAGs都属于假单胞菌科，Bin73中含有16个DRGs，主要属于EPS分泌系统（5个）、细胞膜通透性（4个）、外排泵系统（4个）以及氧化应激（3个）系统（图6A）。此外，在Bin73基因组中还比对到2个ARGs，且都与与DRGs在基因位置上紧密相邻。Bin15同样有16个DRGs，分别属于氧化应激（5个）、EPS分泌系统（5个）、外排泵系统（3个）和细胞膜通透性（3个）系统（图6B）。Bin15基因组中含有1个ARGs。以上结果表明，高抗菌株基因组上大量的DRGs为细菌在高氯环境下存活提供了强大的抗性；而且高抗菌株还同时携带ARGs，表明其对消毒剂和抗生素具有共抗性。通过AntiSMASH次级代谢产物预测，发现这两种细菌中存在13种次级代谢产物合成基因簇（图6C），具有较强的改善环境的能力。

图6. 两个高抗消毒细菌的比较基因组及代谢潜力

A：Bin73与Pseudomonas khazarica ODT-83a。B：Bin15与Stutzerimonas chloritidismutans 6L11。红色圈代表菌株的MAGs，蓝色圈代表参考基因组

C：AntiSMASH预测的次级代谢产物合成基因簇。

讨论

Discussion

与我们之前的研究（Tang et al., Water Research, 2023）相比，本次研究开展于夏季且地点不同，即两次实验的环境温度和起始细菌群落不同。然而，实验结果表明，无论温度或起始细菌群落是否一致，海水经消毒后原核群落均能迅速恢复，这是一种普遍现象。传统上，消毒后DRB的存在被认为有助于群落的恢复；然而，本研究发现消毒后微生物之间的协同互作在促进原核群落的快速恢复中也具有至关重要的作用。此外，漂白粉消毒并未有效去海水中的ARGs，因为海水细菌对消毒剂和抗生素具有共抗性，消毒后有助于ARGs在水中的存留，这一发现扩展了我们对海水中多重耐药机制的认知。两种高抗消毒的DRB基因组携带了多个DRGs和ARGs，使其能够在消毒环境中生存，并可能促进ARGs的传播。因此，当前在海水养殖中使用的消毒策略可能通过促进细菌对各种消毒剂的共抗性，带来环境和公共卫生风险。未来，采用与氯基消毒剂机制不同的二次消毒方法，如紫外线或臭氧处理，可能有效缓解这些潜在风险。

参考文献

第一作者简介

闫娇娇，宁波大学海洋学院2021级硕士生，研究方向为水体微生物生态。现为上海承葛医药科技有限公司生信工程师，负责微生物组分析新方法流程搭建及基于微生态NGS大数据挖掘活菌药物靶点菌株相关研究。

张新旭，深圳大学高等研究院，研究员，博士生导师。博士毕业于上海交通大学，主要从事水产微生物生态与深部生物圈方面的研究工作，先后主持4项国家级、1项省级和2项市级科研项目，包括1项国家基金委重大研究计划培育项目、面上项目和青年基金项目。近年来，在海洋无脊椎动物的血淋巴菌群、免疫与健康养殖等方面做了大量工作，以第一或通讯作者发表论文16篇（包括Trends in Microbiology、Science China Life Sciences、Molecular Biology and Evolution、Water Research、Applied and Environmental Microbiology、Developmental and Comparative Immunology、mSystems等），已授权国家发明专利4项。获得2023年“简浩然环境微生物基金”优秀论文奖（排名第1），2021年深圳市优秀自然科学学术论文奖（排名第6）。团队聘博士后2人，感兴趣的请联系：2310394018@email.szu.edu.cn。

通讯作者简介

张德民，宁波大学海洋学院教授。农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室“微生物与水域生态健康”团队负责人。中国生态学会微生物生态专委会顾问主任，中国水产微生物生态与资源专委会副主任。主持完成国家863项目1项，国家自然科学基2项，浙江省杰青项目1项。国际上率先应用微生物组学研究养殖环境—微生物群落—对虾健康三者之间的动态互作关系，系统揭示了微生物群落稳态在对虾养殖健康中的核心作用，提出基于微生态视角的对虾健康养殖新理念新路径。在Microbiome、Water Research、 npj Biofilms and Microbiome、Molecular Ecology、Aquaculture等微生物学、生态学和水产学权专业期刊发表论文90余篇，授权专利6项。

张化俊，宁波大学海洋学院，副教授，博士生导师。2015年毕业于厦门大学，获博士学位；于2019年6月赴美国加州大学圣地亚哥分校Scripps海洋研究开展为期1年的访学交流。长期从事强烈环境扰动下（如海水增温、余氯）海洋微生物生态系统的响应特征及机制研究。主持国家自然科学基金项目2项，浙江省自然基金2项，厅市级项目5项，横向项目3项；做为骨干成员参与NSFC区域创新发展联合基金（宁波）重点项目1项。在Water Research、 Environmental Microbiology、Science of the Total Environment、Applied and Environmental Microbiology、mSphere（2024当期封面论文）、Microbial Ecology等刊物发表论文40余篇。Frontiers in Microbiology 杂志Associate Editor。

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来源：微生物组