摘要：L-乳酸 (L-Lactic acid)是细胞糖酵解途径重要的代谢产物，它的生物学功能因肿瘤细胞中Warburg effect的存在，而得到了广泛关注。2019年，芝加哥大学赵英明教授团队在Nature上首次报道L-乳酸能够介导组蛋白赖氨酸发生L-乳酰化修饰
L-乳酸 (L-Lactic acid) 是细胞糖酵解途径重要的代谢产物，它的生物学功能因肿瘤细胞中Warburg effect的存在，而得到了广泛关注。2019年，芝加哥大学赵英明教授团队在Nature上首次报道L-乳酸能够介导组蛋白赖氨酸发生L-乳酰化修饰 (L-Lactylation, KL-la)，p300催化乳酰辅酶A将其乳酰基共价修饰到组蛋白赖氨酸上。乳酰辅酶A被认为是L-乳酰化修饰的前体，p300是第一个被鉴定的组蛋白乳酰转移酶（writer）[1]。随后一系列研究进一步揭示了L-乳酰化修饰的调控酶，包括writer：p300、CBP、MOF、HBO1、Tip60；去乳酰化酶（eraser）：HDAC 1-3、Sirt 1-3；和乳酰化阅读器（reader）：Brg1。2024年，赵英明教授及合作者定量了乳酰化的L/D两种修饰异构体，证明L-乳酰化是哺乳动物细胞中的主要乳酰化修饰类型[2]。目前对于细胞中催化L-乳酸生成乳酰辅酶A的代谢酶仍然未知。
GTPSCS是琥珀酰辅酶A合成酶（SCS）家族的一员。最初被认为是一种存在于线粒体内的代谢酶。根据底物特异性，哺乳动物中鉴定出两种形式的SCS：GTP特异性SCS (GTPSCS) 和ATP特异性SCS (ATPSCS)。三羧酸循环中的线粒体ATPSCS主要参与分解代谢，将琥珀酰辅酶A转化为琥珀酸以产生ATP，这一过程被称为底物水平磷酸化；而线粒体GTPSCS则更倾向于合成代谢，在肝脏中参与酮体和卟啉的生成，且在正常脑组织中不表达。目前对于GTPSCS是否存在于细胞核中，以及其细胞核内生理功能未知。此外，GTPSCS在脑胶质瘤中的表达情况以及对脑胶质瘤发生的作用未知。
2024年12月5日，芝加哥大学赵英明教授团队与中国科学院上海药物研究所黄河教授团队，联合芝加哥大学/霍华德·休斯医学研究所（HHMI）酶学领域专家林和宁，西南医学中心/HHMI脑胶质瘤领域专家Ralph J. DeBerardinis，哈佛医学院化学生物学领域专家Philip A. Cole在Cell Metabolism（IF=27.7）期刊发表了题为“Nuclear GTPSCS functions as a lactyl-CoA synthetase to promote histone lactylation and gliomagenesis”的最新研究成果[3]。本研究通过结构生物学、蛋白质组学以及分子与细胞生物学等方法，首次发现细胞核中GTPSCS是乳酰辅酶A合成酶，从源头阐明了组蛋白L-乳酰化修饰前体——乳酰辅酶A的合成机制。首次揭示了GTPSCS的细胞核内功能及其调控脑胶质瘤进展的机制。相比正常脑组织，脑胶质瘤高表达GTPSCS，细胞核内GTPSCS利用L-乳酸作为底物产生乳酰辅酶A，同时与p300互作形成乳酰转移酶复合物，进而介导形成H3K18la，促进GDF15基因表达和脑胶质瘤发生。景杰生物为该研究提供了乳酰化泛抗体、组蛋白特异位点乳酰化修饰抗体等系列14款抗体支持。
01
GTPSCS可调控细胞内组蛋白L-乳酰化水平
SCS的两种同工酶均由一个“α亚基”和一个“β亚基”组成，其中“α亚基”由基因SUCLG1编码（G1亚基），“β亚基”则分别由GTPSCS中的基因SUCLG2（G2亚基）或ATPSCS中的基因SUCLA2（A2亚基）编码。
通过多数据库联合分析，研究人员选定了12个候选的酯酰辅酶A合成酶基因，并对这些基因在HEK293T细胞内进行逐个敲低。结果发现，敲低SUCLG1能显著降低细胞中组蛋白L-乳酰化水平。进一步的研究发现，敲低SUCLG2而非SUCLA2可以显著降低组蛋白L-乳酰化水平。这些结果提示GTPSCS参与细胞内组蛋白L-乳酰化水平的调控。
图1 GTPSCS调控组蛋白L-乳酰化水平
02
GTPSCS的表达量与脑胶质瘤恶性程度呈正相关，且影响组蛋白L-乳酰化和乳酰辅酶A的水平
早期研究发现，GTPSCS在正常脑组织中不表达。转录组联合分析与免疫组织化学实验显示，SUCLG2和SUCLG1的mRNA水平在脑胶质瘤样本中显著高于正常脑组织样本，而SUCLA2则没有这种差异。此外，与其他脑胶质瘤诊断类别相比，SUCLG2在胶质母细胞瘤（GBM）中的表达最高，提示GTPSCS的表达水平与脑胶质瘤的恶性程度相关。研究人员在几种脑胶质瘤细胞系中分别敲低SUCLG1或SUCLG2，组蛋白L-乳酰化和乳酰辅酶A水平显著下降，而琥珀酰化和琥珀酰辅酶A水平没有变化。以上结果说明，脑胶质瘤细胞中GTPSCS可以调节组蛋白L-乳酰化和乳酰辅酶A水平，可能具有乳酰辅酶A合成酶活性。并且GTPSCS很可能参与了脑胶质瘤的发生过程。
图2 GTPSCS表达水平与脑胶质瘤恶性程度相关，并调控组蛋白L-乳酰化和乳酰辅酶A的水平
03
GTPSCS-L-乳酸晶体复合物结构进一步揭示其催化机制
研究人员进一步在体外验证了GTPSCS的乳酰辅酶A合成酶活性。质谱发现GTPSCS在体外可利用乳酸生成乳酰辅酶A。为了进一步弄清GTPSCS催化L-乳酸生成乳酰辅酶A的催化机制，研究人员将原核纯化的GTPSCS与L-乳酸进行了共结晶实验。复合物晶体结构（PDB: 8Z03；分辨率：1.99 Å）揭示GTPSCS和L-乳酸分子的G365/V367/N308氨基酸相互作用。点突变GTPSCS与L-乳酸的结合位点氨基酸N308后，显著降低了乳酰辅酶A合成酶活性，同时也显著降低了细胞内乳酰辅酶A和组蛋白L-乳酰化修饰的水平。以上结果说明GTPSCS在体内和体外都具有乳酰辅酶A合成酶活性，并在原子层面揭示了GTPSCS催化L-乳酸生成乳酰辅酶A的机制。
图3 GTPSCS催化乳酰辅酶A合成的分子机制
04
GTPSCS核转位是调控组蛋白乳酰化作用所必须的
GTPSCS本身是一种线粒体酶，上述结果表明GTPSCS可影响细胞核内组蛋白乳酰化修饰的水平。因此，研究人员进一步探究了GTPSCS核内表达情况。免疫荧光、亚细胞分离结果表明，GTPSCS的两个亚基在细胞核中均有表达，表明GTPSCS可以定位在细胞核中，发挥其乳酰辅酶A合成酶功能。
研究进一步揭示了GTPSCS的核定位机制。SUCLG1编码的G1亚基中存在一个高度保守的核定位信号序列：192-KKGR-195。K192氨基酸位点突变，可以抑制GTPSCS进入细胞核，显著降低细胞组蛋白乳酰化和乳酰辅酶A的水平。以上结果表明，核定位信号是GTPSCS定位到细胞核的分子开关，对于细胞核内生物学功能至关重要。
图4 GTPSCS的核定位信号对于组蛋白L-乳酰化的调控至关重要
05
GTPSCS与p300协同促进H3K18la的表达
研究进一步确定了GTPSCS与p300形成复合物，介导组蛋白L-乳酰化修饰的机制。首先基于质谱分析、免疫共沉淀等实验研究，发现乳酰化转移酶p300是GTPSCS的主要互作蛋白之一。SUCLG2 K73位点的乙酰化对于增强GTPSCS与p300的相互作用至关重要。K73位点突变显著降低了细胞组蛋白L-乳酰化水平。
两方面的证据表明GTPSCS与p300的互做对于组蛋白L-乳酰化至关重要。首先，SUCLG2中的K73位点突变破坏了GTPSCS与p300的相互作用，从而降低了组蛋白Kla水平。其次，尽管ATPSCS在体外具有较高的乳酰辅酶A酶活性，但它无法与p300结合，对组蛋白Kla没有调控作用。
接下来的正反向SILAC定量质谱分析和位点特异性抗体验证结果表明，GTPSCS主要对组蛋白H3K18位L-乳酰化具有调控作用。
图5 GTPSCS与p300协同促进组蛋白L-乳酰化与H3K18la的表达
06
体外实验揭示GTPSCS/p300复合物对组蛋白L-乳酰化修饰的偏好性
研究人员测定了细胞核内L-乳酸和琥珀酸的生理浓度，比较了GTPSCS在L-乳酸和琥珀酸以细胞核内生理浓度条件下同时存在时的酶活性。结果发现GTPSCS产生的乳酰辅酶A是琥珀酰辅酶A的2至6倍。此实验说明与琥珀酸相比，GTPSCS在细胞核内更倾向于催化L-乳酸生成乳酰辅酶A。研究人员进一步的探究了GTPSCS/p300复合物利用L-乳酸以及p300利用乳酰辅酶A或琥珀酰辅酶A体外催化组蛋白L-乳酰化的能力。体外L-乳酰化实验表明：GTPSCS/p300复合体能够有效地利用乳酰辅酶A，催化组蛋白的L-乳酰化，且对组蛋白L-乳酰化的催化效率明显高于琥珀酰化。
综上所述，三个因素决定了GTPSCS/p300复合物倾向于催化组蛋白L-乳酰化而非琥珀酰化。首先，在L-乳酸或琥珀酸处于细胞核内生理浓度的情况下，GTPSCS倾向于生成乳酰辅酶A而非琥珀酰辅酶A。其次，体外L-乳酰化实验表明p300能够高效利用乳酰辅酶A催化组蛋白L-乳酰化，但对琥珀酰化反应活性极低。再者，GTPSCS与p300的蛋白互作表明核内GTPSCS原位生成的乳酰辅酶A可直接被p300用于催化组蛋白L-乳酰化，并且p300对乳酰辅酶A的利用进一步加速GTPSCS对乳酰辅酶A的合成。综合来看，这三个因素决定了GTPSCS/p300复合物在L-乳酰化而非琥珀酰化反应中的特异性活性。
图6 影响GTPSCS/p300对组蛋白L-乳酰化催化偏好性的因素
07
GTPSCS通过H3K18la调控基因GDF15与SCX的表达
研究人员利用13C3-标记的L-乳酸处理脑胶质瘤细胞，鉴定到了H3K18位点13C3-标记的L-乳酰化。敲低SUCLG2可以显著降低H3K18位点13C3-标记的L-乳酰化水平。上述实验进一步佐证了GTPSCS调控H3K18la的能力。为探索GTPSCS调控脑胶质瘤发生的相关机制及其调控的下游基因，研究人员通过ChIP-Seq和RNA-Seq联合分析，发现H3K18la修饰在GDF15、SCX基因启动子区域显著富集，且GTPSCS的核定位信号突变和介导与p300互作的SUCLG2 K73位乙酰化位点突变直接影响GDF15的表达水平。
图7 GTPSCS通过H3K18la调控基因GDF15与SCX表达
08
GTPSCS通过介导组蛋白L-乳酰化和GDF15的表达调控脑胶质瘤进展
先前的研究将GDF15与胶质母细胞瘤的不良预后和免疫逃逸联系在一起，而目前尚无关于SCX在脑胶质瘤中功能的报道。功能验证发现，GTPSCS的表达水平与脑胶质瘤细胞的增殖能力密切相关，GTPSCS核定位信号突变以SUCLG2 K73乙酰化位点突变可以抑制组蛋白L-乳酰化、H3K18la、GDF15进而抑制GSCs的增殖。而单独恢复GDF15的表达，可以在组蛋白L-乳酰化被抑制的条件下，很大程度上恢复GSCs的增殖能力。免疫组化实验表明，细胞核内GTPSCS表达量与H3K18la水平呈正相关。细胞核内GTPSCS以及H3K18la表达水平与脑胶质瘤恶性程度呈正相关。以上结果表明GDF15是GTPSCS/p300/H3K18la轴的主要靶点，并在脑胶质瘤进展中发挥关键作用。
图8 细胞核内GTPSCS促进脑胶质瘤细胞增殖和脑胶质瘤形成
综上所述，该研究揭示了GTPSCS作为脑胶质瘤细胞核内的乳酰辅酶A合成酶，利用L-乳酸作为底物，通过SUCLG2 K73位点乙酰化，与p300相互作用，进而催化介导H3K18Kla，最终促进GDF15基因转录和脑胶质瘤的进展。总之，该研究完善了由L-乳酸衍生为L-乳酰化修饰的研究体系，并为脑胶质瘤的治疗提供了新的潜在靶点。
图9 作用模式图
本研究主要由芝加哥大学赵英明研究组/中国科学院上海药物研究所黄河研究组合作完成。芝加哥大学/中国科学院上海药物研究所博士后刘瑞隆为本文第一作者，赵英明研究员和黄河研究员为该论文的共同通讯作者。酶学领域专家林和宁，脑胶质瘤领域专家Ralph J. DeBerardinis和生物学领域专家Philip A. Cole也参与了本工作。
景杰评述
本研究填补了L-乳酰化修饰前体——乳酰辅酶A来源机制的空白，诠释了GTPSCS/p300作用轴介导组蛋白发生L-乳酰化的完整生物学过程，是对整个L-乳酰化修饰研究通路的重要补充。
此外，研究精细解码了GTPSCS/p300/H3K18la作用轴中的每一个环节，并找到了调控脑胶质瘤生长的重要靶点GDF15。研究结果进一步拓展了乳酰化修饰研究的切入点，也为后续研究提供了一个范例。后续研究可进一步关注GTPSCS蛋白及其亚基与各种生理和病理相关疾病的关联，结合乳酰化修饰完成创新研究。
2024年，正值乳酰化修饰发现五周年，乳酰化修饰调控的深刻内涵和重要研究价值日益显现。在不到一年的时间里，4篇乳酰化重磅成果登上CNS正刊。一系列明星蛋白，如MRE11[4]，NBS1[5]，PD-L1[6]等均可发生L-乳酰化修饰并改变它们的功能。同时，L-/D-两种修饰异构体的定量，揭示了L-型乳酰化是组蛋白乳酰化的主要类型。乳酰化的精准研究已经迈向了全新时代！
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参考文献：
[1] Zhang D, et al. 2019, Metabolic Regulation of Gene Expression by Histone Lactylation. Nature.
[2] Zhang D, et al. 2024. Lysine L-lactylation is the dominant lactylation isomer induced by glycolysis. Nat Chem Biol.
[3] Ruilong Liu, et al. 2024. Nuclear GTPSCS functions as a lactyl-CoA synthetase to promote histone lactylation and gliomagenesis. Cell Metabolism.
[4] Yuping Chen, et al. 2024. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell.
[5] Hengxing Chen, et al. 2024. NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance. Nature.
[6] Tong H, et al. 2024. Dual impacts of serine/glycine-free diet in enhancing antitumor immunity and promoting evasion via PD-L1 lactylation. Cell Metab.
来源：景杰生物
