摘要：在生物制药行业抗体药生产中，纯化一直是至关重要的一环。传统的离子交换层析纯化方法主要依赖盐梯度洗脱，但近年来，高线性pH梯度法在复杂分子（如双特异性抗体BsAb）的纯化中展现出更高的选择性和更好的分离效果。今天，我们将向大家介绍pH梯度法的应用，并探讨其优势与

在生物制药行业抗体药生产中，纯化一直是至关重要的一环。传统的离子交换层析纯化方法主要依赖盐梯度洗脱，但近年来，高线性pH梯度法在复杂分子（如双特异性抗体BsAb）的纯化中展现出更高的选择性和更好的分离效果。今天，我们将向大家介绍pH梯度法的应用，并探讨其优势与挑战，助力大家在工艺开发中做出更合适的选择。

什么是pH梯度法？

pH梯度法是一种基于调节缓冲液pH的层析分离条件。通过连续变化的pH梯度，调节蛋白质的带电荷状态，从而影响其与离子交换层析介质的相互作用，达到分离的目的。其核心原理是：

-不同分子在不同pH条件下电荷状态不同

-通过pH变化调整蛋白与填料的相互作用强度

-可以在更精细的范围内进行洗脱，提高分离效果

双特异性抗体（BsAb）因其独特的结构和治疗潜力，近年在生物制药领域备受关注。然而，由于其复杂的分子结构，双抗的下游纯化面临更大挑战，其杂质包括聚集体、片段和错配分子。pH梯度法相比传统的盐梯度法，能够更好地分离不同构型的蛋白，如单体、二聚体、聚集体及错配体，特别适用于结构复杂的分子分离。

pH梯度法的主要优势

1.更高的选择性

-相比盐梯度，pH梯度可以更精细地利用蛋白质的等电点（pI）差异，适用于复杂分子的精细分离。

-可用于分离单体、二聚体、聚集体及错配体，提升最终产品纯度。

2.温和的洗脱条件

-由于不依赖高盐浓度洗脱，对某些蛋白更友好，降低聚集体的形成风险。

-适用于对高盐浓度敏感的分子。

3.可用于优化下游工艺

-通过缓冲液混合形成线性pH梯度，可精确控制洗脱条件。

-可结合离子交换填料（IEX），增强对杂质的去除效果。

pH梯度法的局限性

1.方法优化复杂

-pH梯度的建立需要选择合适的缓冲体系，且需要精细调整不同pH条件，以保证蛋白稳定性。

-不同批次样品的pH梯度稳定性可能存在偏差，在工艺放大时需要进行额外的验证。

2.设备要求较高

-需要高精度的梯度混合系统。

-需要在线pH监测系统。

3.蛋白稳定性风险

-过酸或过碱的条件可能会导致蛋白变性或聚集。

-需要额外优化pH梯度范围，以降低蛋白损失和变性风险。

pH梯度实验思路

1.首先选择合适的pH范围

-先尝试较宽的pH范围，寻找到同源二聚体、目标抗体、片段化抗体、聚体的出峰pH。

-然后选择低于杂质出峰0.5个pH单位作为起始点，高于目标抗体完整出峰0.5个pH单位作为终点。

-尽量控制pH梯度范围小于3个pH，且不跨越等电点pI，避免抗体沉淀。

2.pH梯度buffer

选择合适的缓冲体系：不同的梯度范围需要不同的缓冲体系。

-如pH4~11：15.6 mM CAPS, 9.4 mM CHES, 4.6 mM TAPS, 9.9 mM HEPPSO, 8.7 mM MOPSO, 11.0 mM MES 13.0 mM Acetate, 9.9 mM formate, 10 mM NaCl, 用NaOH调节pH；

-如pH6~8.5：A:20 mM phosphate buffer, pH 6.0;B:20 mM phosphate buffer, pH8.5；

-如pH10.5~3.5：9.8mM Methylamine、9.1mM 1,2-Ethanediamine、6.4mM 1-Methylpiperazine、13.7mM 1,4-Dimethylpiperazine、5.8mM Bis–tris、7.7mM Hydroxylamine。

如何选择适合自己的方法？

在实际应用中，建议结合具体的工艺目标和蛋白分子特性选择合适的梯度方法：

总结

pH梯度法在去除聚集体、片段化抗体、聚体方面具有显著优势，适用于双抗等复杂分子纯化。但其在方法优化、设备需求和蛋白稳定性方面存在挑战，需要根据具体情况进行权衡。建议在实际工艺开发中，通过小试筛选pH梯度范围，结合在线监测手段，优化pH梯度条件，以获得最佳纯化效果。

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参考文献：

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