Mol Cell | 新生RNA的快速折叠调控真核生物RNA的生物合成

摘要：RNA的催化、调控及编码潜能都依赖于其结构。由于碱基配对发生在转录过程中，早期结构状态可调控RNA加工过程并决定功能性构象的形成，而这些共转录状态至今仍不清楚。

撰文 | 一只鱼

RNA的催化、调控及编码潜能都依赖于其结构。由于碱基配对发生在转录过程中，早期结构状态可调控RNA加工过程并决定功能性构象的形成，而这些共转录状态至今仍不清楚。

近日，来自美国耶鲁大学的Karla M. Neugebauer研究团队在MolecularCell上发表题为Rapid folding of nascent RNA regulates eukaryotic RNA biogenesis的文章，开发了一种可在RNA聚合酶合成过程中检测新生RNA结构的方法，发现碱基配对在细胞内迅速形成，揭示了新生RNA结构具有强大的调控潜力。与pre-mRNA不同，rRNA结构需要经历广泛的重塑过程，这一过程由Dbp7等解旋酶在共转录阶段完成。

为了研究真核生物新生RNA的碱基配对状态，研究人员开发了一种基于生物素-NTP转录延伸和DMS甲基化处理的方法CoST-seq，可在活体酵母细胞中以转录组规模检测RNA聚合酶（Pols）内部及出口处新生RNA的碱基配对情况。具体流程为对酿酒酵母细胞进行透化处理后，孵育生物素化CTP，使其掺入新生RNA的3'端作为标记，使用DMS处理细胞，对未配对碱基（A/C/U）进行甲基化修饰，通过亲和纯化获得生物素化新生RNA，采用嗜热脂肪地芽孢杆菌GsI2c逆转录酶进行反转录，该酶具有模板转换能力，可将甲基化事件转化为cDNA突变，最后连接含7xN独特分子标识符（UMI）的5'端接头后进行高通量测序。通过监测转录过程中每个核苷酸的碱基配对活性，发现配对具有快速性，在加入新生链后25bp的转录范围内即可完成。

核糖体RNA (rRNA) 在成熟状态下具有高度有序的结构和明确的碱基配对模式，为探究新生rRNA与成熟rRNA的折叠差异，他们采用特异性检测成熟rRNA (非多聚腺苷酸化形式) 的DMS-MaPseq数据对新生rRNA的CoST-seq数据集进行补充分析，发现新生与成熟rRNA之间存在显著差异，新生rRNA会形成瞬时中间结构通过体内重排才能达到最终成熟状态。若中间结构在核糖体生物发生过程中后期被重塑，那么RNA Pol I位点的平均结构明确度应降低 (表现为基尼指数下降)。他们发现新生rRNA投影信号始终显示较低的基尼指数，尽管存在最终配对核苷酸，新生rRNA形成的局部碱基对仍与成熟核糖体存在本质差异，表明rRNA在核糖体成熟过程中会形成先前未知的瞬时结构态。为了定量研究共转录RNA折叠的动态特征和碱基配对的发生时序，他们通过整合3'端定位（确定RNA Pol位置）与甲基化率推断（反映A/C核苷酸的配对比例），追踪了DMS反应性随转录进程的变化，发现不同核苷酸呈现不同的行为模式：延迟配对、不配对、即时配对或渐进性解配对。由于近半数pre-rRNA核苷酸在转录早期保持未配对状态，且pre-rRNA中形成的共转录结构必须经历后续重排，他们推测RNA解旋酶可能在转录过程中就参与维持新生RNA的灵活性。他们重点关注两个与pre-60S rRNA加工相关的非序列特异性RNA解旋酶（Dbp3和Dbp7）以及G4四链体结合蛋白Stm1，构建了相应的敲除株。通过CoST-seq与DMS-MaPseq数据分析，发现Dbp7对大亚基合成影响最显著，dbp7Δ中多个位点的碱基配对时序与程度发生显著改变，RNA解旋酶Dbp7的作用几乎贯穿整个新生pre-rRNA，通过维持核糖体大小亚基的合成平衡促进核糖体生物发生。最后，由于pre-mRNA经历共转录剪接和mRNP组装过程，但其结构是否发生重排、或如何受翻译过程影响仍不清除，于是他们比较了新生与成熟RNA在共有区域（不含内含子）的反应性，发现绝大多数转录本的新生与成熟RNA结构高度一致。