摘要：复杂有机污染物（如石油及炼油废水）常含多环和单环芳烃，通过大气沉降或原油泄漏进入海洋，严重威胁生态和健康。虽然部分细菌能降解这些污染物，但通常仅针对结构单一的成分，难以应对复杂混合物。相比之下，微生物联合体在处理含多种污染物的海水或盐水中表现更佳，且其在极端环
工程菌可以同时降解五种废水污染物
复杂有机污染物（如石油及炼油废水）常含多环和单环芳烃，通过大气沉降或原油泄漏进入海洋，严重威胁生态和健康。虽然部分细菌能降解这些污染物，但通常仅针对结构单一的成分，难以应对复杂混合物。相比之下，微生物联合体在处理含多种污染物的海水或盐水中表现更佳，且其在极端环境（如高盐、高酸碱）下的适应性也是关键因素。合成生物学的发展为构建高效降解菌株提供了新思路。需钠弧菌（Vibrio natriegens）作为增长最快的已知细菌，具有耐盐性强、碳源利用广等优势，并已建立多种基因编辑工具，是开发生物修复菌株的有前景载体。
基于此，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所戴俊彪研究员联合上海交通大学唐鸿志教授利用合成生物学技术对需钠弧菌进行了改造，成功开发出一种能够处理含盐废水及土壤中多种有机污染物的工程菌株。研究团队首先将关键调控基因tfoX整合到V. natriegens Vmax菌株的1号染色体上，并通过过表达显著提升了细菌摄取和整合外源DNA的能力。随后，在酵母系统中化学合成了多个降解基因簇，并创新性地开发了基于Vmax的迭代自然转化方法（利用增强的tfoX效应），成功将5个总长达43kb的基因簇转入工程菌株。实验证明，这种改造后的Vmax菌株能够有效降解氯碱厂和炼油厂废水中的多种典型污染物，包括联苯、苯酚、萘、二苯并呋喃和甲苯等，处理范围覆盖从单环到多环的各类有机化合物。这项研究为工业废水处理提供了新的生物修复解决方案。相关成果以“Bioremediation of complex organic pollutants by engineered Vibrio natriegens”为题发表在《Nature》上，第一作者为苏聪，Haotian Cui, Weiwei Wang为共同一作。
戴俊彪研究员和唐鸿志教授
底盘菌株的选择
作者评估了需钠弧菌 V. natriegens Vmax 是否适合用于有机污染物修复，并与常见降解菌如P. putida KT2440 和 B. xenovorans LB400 进行了比较。在高盐培养基中，Vmax 的生长表现优于其他菌株，且在含联苯、苯酚、萘等污染物的高盐环境下也能保持较好增殖，表现出较强的耐盐和耐污染能力（图2a）。进一步的转录组分析显示，在有机污染物胁迫下，Vmax 大量上调了与污染物转运和排出相关的基因，包括 efflux 泵系统 marA 和acrAB–tolC，这有助于其在复杂污染环境中生存。这些结果表明，Vmax 具备作为高盐环境下生物修复工具菌的潜力。
图 1：用于修复复杂有机污染物的菌株的构建和底盘细胞的选择
生成优化的VCOD-2菌株
为提升转化效率和蛋白表达，作者在 V. natriegens Vmax 中删除了约150个基因，并通过 sfGFP 报告基因测试不同启动子活性，发现构成型 P25 和 IPTG 诱导型 PT7 启动子表达最强。为增强其天然转化能力，作者引入转录因子 tfoX，构建出能自发吸收外源 DNA 的新菌株 VCOD-1，并通过可视化标记 wbfF 评估其转化效率。随后，作者将 tfoX 整合至 Vmax 染色体1的特定位点，得到无抗性标记、稳定性更高的 VCOD-2。VCOD-2 对质粒和线性 DNA 片段的转化效率明显提高，尤其在 DNA 量超过 5 ng、长度大于 1 kb 时效果最佳（图2d,e），且其生长性能未受影响（图2f）。进一步，作者筛选了 Vmax 染色体2上的12个非必需基因位点用于稳定插入降解通路，并用 sfGFP 验证表达效果和整合效率，其中 chr2_297 位点表现最优，整合效率达 76.9%，且不影响菌株生长（图2i）。这些结果表明 VCOD-2 是一个性能优异、适用于合成生物学的工程底盘菌。
图2 ：开发无辅助质粒基因转移方法和Natriegens V. Natriegens的启动子的选择
插入降解基因簇的插入
作者合成了9个针对典型有机污染物（如苯、甲苯、苯酚、萘、联苯、DBF和DBT）的降解基因簇，并将其整合至V. natriegens Vmax染色体chr2_297位点，构建出VCOD-3至VCOD-11共九株工程菌（图3a）。在模拟高盐废水环境中，这些菌株对目标污染物的降解效果通过UPLC-MS检测得到验证，其中VCOD-3至VCOD-7分别显著降低了联苯、苯酚、萘、DBF和甲苯的浓度（图3b–f），并生成了如儿茶酚、水杨酸和苯甲酸等典型代谢产物，同时检测到多个降解中间体。相比之下，VCOD-8至VCOD-11未能有效降解其对应的目标物（图3g–j）。在IPTG诱导下，插入的基因簇均可在Vmax中稳定表达，且对细胞生长无明显抑制（图3k）。基于上述表现，作者将VCOD-3至VCOD-7构建为合成菌群，在48小时内可协同降解30.8%的联苯、22.6%的苯酚、100%的萘、29.2%的DBF及93.4%的甲苯（图3l），展现出处理复杂有机污染混合物的协同优势和广泛应用前景。
图3 ：合成降解基因簇的插入和体内检查
复杂的有机污染物生物修复
为实现多种有机污染物的同时降解，作者采用逐步整合策略将五个降解基因簇依次插入工程菌VCOD-2的染色体，最终构建出复合菌株VCOD-15（图4a）。该菌株在48小时内可同时去除100%联苯、60.7%苯酚、71.8%萘、89.3% DBF 和89.9%甲苯（图4c–g），降解基因簇表达良好（图4b），代谢产物符合预期，未产生异常中间体。VCOD-15的生长能力未受影响（图4h），基因组中各插入位点经PCR和测序确认稳定存在，表明该菌株具备高效、稳定的复合污染物生物修复能力。
图4 ：检查VCOD-15和基因表达水平对复杂有机污染物的修复
废水中的污染物修复
作者评估了工程菌株 VCOD-15 在实际工业废水中的复合污染物治理能力。VCOD-15可在模拟海水中同时降解五种芳香类污染物，接着我们进一步验证其在高盐度石化工业废水（BZ I 和 DL I）中的适应性和修复效果。结果显示，VCOD-15在两种废水中均能正常生长，表现出对污染物的耐受性优于其它候选菌株（图5a–b）。与自然降解菌（P. putida B6-2 和 LB400）相比，VCOD-15对目标污染物联苯表现出更强的去除能力（图5c–d）。随后，作者构建了一个活性污泥反应器，使用VCOD-15处理两种工业废水，在12小时内成功降解了五种污染物（图5e–j）。为了进一步验证VCOD-15作为生物制剂的实际应用潜力，作者在未经灭菌的废水中进行48小时多联反应器实验（BZ II 和DL II），加入酵母粉作为碳源。最终，VCOD-15在BZ II中去除了超过97%的所有五种污染物，在DL II中也表现出优异的去除效果，尤其对萘和甲苯的去除率接近100%。
小结
本研究通过整合五个有机污染物降解基因簇，构建了工程菌株 VCOD-15，具备在高盐工业废水中同时降解联苯、苯酚、萘、二苯并呋喃（DBF）和甲苯的能力。VCOD-15 不仅在模拟海水和实际废水中表现出良好的生长性和耐受性，还在反应器中实现了对五种污染物超过97%的去除率（图5）。微生物群落分析表明其在复杂环境中具备竞争优势。该菌株具有基因稳定性和工程扩展性，为工业废水中复合污染物的高效生物修复提供了可靠方案。
来源：高分子科学前沿一点号1
