摘要:脂筏(lipid raft microdomains, LR)是细胞膜上富含胆固醇和鞘脂的微小结构域(图1),具有独特的物理化学特性,可作为信号转导、细胞黏附和蛋白质运输等关键生物学过程的调控枢纽。近年研究发现,LR的功能异常与多种疾病密切相关,包括肿瘤、神经
脂筏(lipid raft microdomains, LR)是细胞膜上富含胆固醇和鞘脂的微小结构域(图1),具有独特的物理化学特性,可作为信号转导、细胞黏附和蛋白质运输等关键生物学过程的调控枢纽。近年研究发现,LR的功能异常与多种疾病密切相关,包括肿瘤、神经退行性疾病和心血管疾病等。由于其重要的病理生理作用,以LR为靶点开发新型治疗策略已成为当前研究热点。
霍乱毒素B亚单位
霍乱毒素B亚单位(Cholera Toxin B subunit, CTB/ CTxb)是一种广泛应用于脂筏(Lipid Rafts)标记、内吞作用研究和神经科学的经典工具。爱必信提供的CTB 可用作神经元示踪剂、细胞膜标记、免疫佐剂等。产品经过严格优化,适用于高分辨率成像、流式分析和功能研究。
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特色应用案例
2024年10月,上海交通大学医学院药理学与化学生物学系俞志华研究团队在Translational Neurodegeneration(IF=10.8)上发表了题为“TRPV1 alleviates APOE4-dependent microglial antigen presentation and T cell infiltration in Alzheimer’s disease”的研究论文,文中CTxb-FITC(abs80003,霍乱毒素B亚单位偶联FITC) 被用作脂筏标记物,用于研究 APOE4 对微胶质细胞脂筏结构及抗原呈递功能的影响,以及 TRPV1 通道的调控作用。
CTxb-FITC在该研究中用于标记细胞膜上的脂筏,具体功能包括:
脂筏定位:CTB结合细胞膜上的GM1神经节苷脂(脂筏的标志性成分),通过FITC荧光标记可视化脂筏的分布。
共定位分析:与MHC II分子(PE标记)的共定位实验,验证APOE4如何通过胆固醇积累促进MHC II在脂筏中的聚集,从而增强抗原呈递功能。
实验方法[2]
1. CTxb-FITC染色步骤
细胞处理:室温下,用4%多聚甲醛处理BV2小胶质细胞10分钟。
阻断与染色:
阻断液:用含5% BSA的PBS孵育,封闭非特异性位点。
染色:加入CTxb-FITC(8 μg/mL)和MHC II-PE(2 μg/mL),4°C孵育30分钟。然后再用DAPI染色细胞核。
成像:TCS SP8共聚焦显微镜拍摄,ImageJ分析共定位信号。
2. 关键实验流程
细胞模型:BV2小鼠小胶质细胞系,用ApoE3/ApoE4(4 μg/mL)和tau蛋白纤维(PHF)处理。
TRPV1激活:辣椒素(capsaicin, 1 μM, abs817025)预处理30分钟。
脂筏与MHC II共定位:通过CTxb-FITC(abs80003)和MHC II-PE双标,验证TRPV1激活后MHC II从脂筏的移位。
3. 其他相关方法
流式细胞术:分析MHC II表达。
钙成像:Fluo-4 AM检测胞内钙信号(abs47014952)。
免疫荧光:共聚焦显微镜观察脂筏、MHC II、溶酶体(LysoTracker, abs47038871)等。
注意事项
1. 样品处理与固定
避免过度固定:使用4%多聚甲醛(abs9179)固定10-15分钟(室温),避免醛类过度交联破坏脂筏结构。甲醇/丙酮等有机溶剂固定会溶解脂筏,不可使用。
洗涤:固定后用 PBS(无去垢剂) 轻柔洗涤3次,防止脂筏破坏。
2. 阻断与非特异性结合控制
阻断液推荐含5% BSA的PBS 或 1-5% 血清(同源血清最佳),室温阻断30分钟。避免使用含去垢剂(如Triton X-100)的阻断液,以免溶解脂筏。
3. CTB孵育条件
浓度优化:CTB-FITC推荐工作浓度1-10 μg/mL(需预实验确定,过高浓度增加背景),用PH7.4的PBS稀释。
孵育时间与温度:4°C孵育30分钟(减少内吞作用,保持膜表面GM1标记)。若需标记内化GM1,可改为 37°C孵育15-30分钟。
避光操作:CTB-FITC对光敏感,全程避光。
4. 共定位实验设计
多色标记顺序:先染CTB-FITC(脂筏),固定后再染其他抗体(如MHC II)。若需胞内抗原(如溶酶体蛋白),需在CTB染色后透化(0.1% Saponin,abs815978)。
对照设置:
阴性对照:用甲基-β-环糊精(Me-β-CD,2-5 mM,abs47047467)预处理细胞耗竭胆固醇,CTB信号应消失。
阳性对照:胆固醇富集处理(如LDL加载)。
常见问题&解决方案
来源:张花花说事件