摘要：动脉粥样硬化（AS）是全球发病率和死亡率的主要原因，其特征是内皮功能障碍、慢性炎症和动脉壁斑块形成。尽管他汀类药物是降低血脂和预防并发症的最常用治疗方法，但其疗效在个体间差异显著。因此，探索新的治疗靶点和代谢物对于改善AS的诊断和治疗至关重要。
动脉粥样硬化（AS）是全球发病率和死亡率的主要原因，其特征是内皮功能障碍、慢性炎症和动脉壁斑块形成。尽管他汀类药物是降低血脂和预防并发症的最常用治疗方法，但其疗效在个体间差异显著。因此，探索新的治疗靶点和代谢物对于改善AS的诊断和治疗至关重要。
近期，南昌大学研究团队在《Advanced Science》期刊发表了一篇题为“The Metabolite Indole-3-Acetic Acid of Bacteroides Ovatus Improves Atherosclerosis by Restoring the Polarisation Balance of M1/M2 Macrophages and Inhibiting Inflammation”的研究论文，揭示了肠道微生物与AS之间的复杂相互作用，并提出了一种新的治疗策略。
迈维代谢为本研究提供了靶向胆汁酸和色氨酸代谢检测服务。
1. B. ovatus是冠心病危险因素人群肠道菌群中的关键细菌
研究招募了30名ASCVD患者和30名有冠心病危险因素的志愿者（NP组），以研究肠道菌群对AS的影响。受试者的基线特征和临床数据总结见表1。两组在年龄、体重指数（BMI）、血压、慢性病史、药物使用、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）和LDL-c水平方面无显著差异。然而，ASCVD组的血浆总胆固醇（TC）（p
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图1： B. ovatus是有冠心病危险因素的志愿者肠道菌群中的关键细菌
2. 人类粪便微生物群移植（FMT）调节ApoE-/- 小鼠AS的发展
为了研究肠道微生物群在AS发展中的作用，研究确定了在临床人群中观察到的影响是否可以在动物模型中复制。HFD喂养的Apoe-/-小鼠用ASCVD患者或NP组的粪便进行FMT（图2A）。与对照组（C）相比，喂食HFD的Apoe-/-小鼠（M组）表现出显著的体重增加，具有冠心病风险因素的志愿者（MN组）在FMT后，这一趋势得到缓解（p = 0.0016;图2B）。脂多糖（LPS）（图2C）和炎症标志物（包括IL-6、TNF-α和IL-1β）（图2D）的血清水平表明，接受ASCVD患者FMT的HFD喂养的Apoe-/-小鼠（MC组）比M组经历了更明显的炎症反应。相比之下，与M组相比，MN组表现出TC（29%）、LDL-c（37%）和TG（39%）的显著降低（图2 E）。主动脉重量和解剖学评估显示MC组斑块面积增加，而MN组显示主动脉斑块形成减少。具体而言，主动脉油红“O”染色表明MC组斑块面积增加20%，而MN组减少15%（图2F、G），如主动脉内壁中的代表性斑块形态所证明（图2 H）。对主动脉中的炎症特征的进一步评估显示，与M组相比，MN组中M1/M2巨噬细胞比率降低50%，伴随着炎性趋化因子、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）水平的降低，这些水平在MC组中相对于M组升高（图2G）。Masson三色染色（斑块稳定性的关键指标）显示C组胶原含量正常，M和MC组胶原含量降低，MN组相对于M组增加26%。为了检查脂质代谢紊乱的起源，研究通过油红“0”染色定量肝脏脂肪沉积（图2 J，K）。与M组相比，MN组表现出70%的减少。还存在肝脏固体重量和肝脏评分的降低（图2L），突出了来自NP组的FMT对肝脏脂质代谢的有益作用。由于肠道是FMT的主要靶点，因此研究评估了该干预后的状况。测量结肠长度和隐窝深度（图2 M），以及通过HE染色进行的组织学分析，显示M和MC组的结肠隐窝较浅且较短。相反，MN组在这些参数方面表现出显著改善，表明肠道结构恢复。使用阿尔新蓝-高碘酸希夫（AB-PAS）染色的进一步分析显示，在MandMC组中杯状细胞减少，表明肠功能受损，而MN组显示杯状细胞数量增加（图2N，O）。肠通透性蛋白的表达，包括闭合小带1（ZO-1）和闭合蛋白（图2 O），它们是肠屏障完整性的关键标志物，在MN组中显著增强，表明被HFD破坏的肠功能恢复。最后，FMT后的粪便微生物群分析证实，在抗生素治疗后，来自ASCVD患者和NP组的人源化微生物群有效地定殖在小鼠肠道中，验证了FMT的成功。
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图2：人FMT可调节Apoe-/-小鼠AS的发育
3. B. ovatus调节胆汁酸和脂质代谢减轻AS
为了探讨B. ovatus的治疗潜力。研究首先在体外评价了NP组肠道菌群中的关键细菌--卵形菌的益生特性。基于耐药试验和抑菌试验，B. ovatus对抗生素表现出部分耐药性，对常见肠道病原菌表现出明显的抑制作用。此外，B.卵形芽孢杆菌显示出对胆盐的耐受性和对肠上皮细胞的强粘附性，支持其在体内的潜在功能作用。为了评估其体内作用，研究用B.卵形（BO组）（图3A）。与M组相比，BO组的体重显著降低（p = 0.0384）（图3B）。与M和MC组相比，BO组的LPS、炎症因子（图3C、D）和脂质（图3E）的血清水平显著改善。根据油红“O”染色（图3F）和斑块面积定量，主动脉斑块形成（AS的一个关键标志）的评价显示MC组的斑块面积增加7%，而BO组减少16%。同样，肝油红“O”染色（图3G）和肝脏评分证实了B.卵圆藻能减少肝脏脂肪沉积，减轻肝脏损伤。结肠长度和隐窝深度的评估表明B.卵圆形定植使结肠结构得到恢复。此外，肠完整性改善，表现为屏障蛋白ZO-1和occludin水平升高。BO组的全身炎症减轻，表现为脾脏和附睾重量改善。体外粘附试验证实B.结果表明，在大肠杆菌感染中，B. ovatus与肠细胞的粘附率分别为95. 7%和95. 7%;卵特异性引物证实了其在小鼠睾丸中的成功定植，证实了其作为AS治疗剂的潜力。为进一步探讨双歧B的降胆固醇机制。研究对C、M和BO组的粪便样本进行了胆汁酸靶向代谢组学研究（图3 H）。BO组显示出有益胆汁酸（如脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA））水平显著升高，同时逆转了HFD诱导的有害胆汁酸（包括胆酸（CA））蓄积。随后，研究检查了与胆汁酸代谢相关的肝脏基因的表达（图3 I）。M组和MC组FXR表达降低，Cyp 7a 1和Cyp 27 a1表达升高，而BO组则相反。肝脏和肠道蛋白质的Western印迹证实了这些发现，显示BO组的表达模式与M和MC组相反（图3 J、K）。值得注意的是，B.卵形抑制了尼曼匹克型C1样蛋白1（NPC 1 L1），这是一种参与肠道胆汁酸转运的关键蛋白（图3L），表明卵形可减少肝肠胆汁酸循环并改善全身胆固醇水平。虽然这些发现强调了B.ovatus在胆汁酸代谢中，慢性炎症仍然是动脉粥样硬化病变的重要驱动因素，即使在胆固醇显著降低之后。B.ovatus产生胆汁盐水解酶（BSH），一种将结合胆汁酸转化为游离胆汁酸的酶，增加胆汁酸排泄并减少肝肠循环，研究的研究证实了这一现象。目前尚不清楚B. ovatus影响炎症独立于胆固醇的变化，因为这些变化与炎症的改善无关。这使研究假设，除胆汁酸外，还有其他代谢物参与了B. ovatus的抗动脉粥样硬化作用。
最近的研究表明，B.ovatus能够产生色氨酸代谢物IAA，其激活芳烃受体（AHR）并减轻HFD诱导的代谢综合征、肝脂肪变性和相关的炎症反应。因此，研究评估了IAA是否也改善了主动脉壁的炎症。为了探索这种可能性，研究对粪便样本进行了色氨酸测定，并证实了B.ovatus确实在小鼠中产生IAA。值得注意的是，与M组相比，BO组粪便（图40）和血清（图3M）中的IAA水平显著升高。重要的是，在临床队列中，NP组中的IAA水平也显著高于ASCVD组（图3N），表明B.ovatus可能通过分泌IAA在AS的调节中起重要作用。
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图3：B.ovatus调节胆汁酸和脂质代谢减轻AS
4. B.ovatus的色氨酸代谢产物IAA在减毒AS中的作用
目的：探讨吲哚乙酸（IAA）对金黄色葡萄球菌（Bacillus.研究通过口服管饲法向喂食HFD的Apoe-/-小鼠给予IAA（图4A）。与M组相比，IAA给药（IAA组）导致体重显著降低（p = 0.0301;图4 B）。此外，IAA处理导致血清LPS水平降低、炎性细胞因子减少（图4C、D）和脂质谱改善（图4 E），表明其在减轻炎症和调节脂质代谢中的双重作用。IAA处理还减缓了AS进展，表现为主动脉实体重量显著降低和油红“O”染色区域减少20%（图4F、G）。主动脉瓣的HE染色显示斑块特征的形态学变化，定量显示斑块面积和坏死核心大小均减少，表明IAA有助于斑块稳定。值得注意的是，与M组相比，IAA组的主动脉胶原含量增加了37%，而VCAM-1（减少了43%）和ICAM-1（减少了38%）显著减少。巨噬细胞亚型的免疫荧光染色表明其向抗炎表型转变，M1/M2平衡改善（图4 H，I）。为了进一步研究IAA对脂质代谢的影响，研究分析了相关器官的脂质谱。IAA处理导致肝脏固体重量和肝脏评分显著降低，沿着肝脏脂质沉积降低70%，如油红“O”染色所示（图4J）。这些发现加强了IAA有效逆转肝脂质蓄积的结论。此外，IAA给药恢复了结肠长度和隐窝深度，而ABPAS染色显示杯状细胞数量增加和隐窝加深，表明肠道形态改善。关键肠屏障蛋白质的Western印迹，包括occludin和claudin-1（图4K，L），证明IAA显著恢复了它们的表达，并因此增强了肠屏障的完整性。考虑到这些全身性的改善，研究假设IAA进入血流并随后促进血管健康。血清分析证实了治疗小鼠中IAA水平升高，支持IAA可直接影响主动脉并改善与AS相关的全身症状的观点。
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图4：B.ovatus色氨酸代谢产物IAA对AS的减毒作用
主动脉组织的RNA测序（RNA-seq）表明，在喂食HFD的Apoe-/-小鼠中，前30个上调的差异表达基因（DEG）中，巨噬细胞相关基因表达发生了实质性改变。此外，在前30个下调DEG中，与平滑肌细胞和收缩功能相关的基因发生了改变（图5A）。炎症标志物（如IL-1和TNF-）的表达增加进一步强调了炎症在AS发病机制中的关键作用（图5 B）。基因本体（GO）富集分析显示，单核细胞，动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的前体，显示出增强的迁移和分化途径，沿着增强的巨噬细胞活化（图5C）。KEGG分析进一步强调了NF-B通路的显著激活，这为后续通路验证提供了依据（图5D）。QPCR显示TLR 4/MyD 88/NF-B通路和相关炎症因子发生显著变化，但脂质代谢通路（包括蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物奥拉帕霉素靶点（mTOR）/缺氧诱导因子1-α（HIF-1）和JAK）无显著变化（图5E）。
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图5：主动脉RNA-seq发现AS的潜在机制
5. IAA调节巨噬细胞M1/M2极化以减轻炎症
在动物模型中，HFD破坏了巨噬细胞M1/M2极化的平衡，IAA已显示出可恢复这一过程，从而通过其对巨噬细胞的作用减轻AS。为了研究该机制，研究通过使用经典刺激物诱导RAW264.7细胞中的M1极化（图6A）。CD 86和AHR的免疫荧光染色显示，IAA抑制LPS +干扰素-γ（INF）诱导的M1极化，与AHR活化无关（图6 B、C）。蛋白质印迹进一步证明，随着IAA浓度的增加，TLR 4和MyD 88（关键炎性蛋白）的表达呈剂量依赖性降低（图6D、E）。这些结果表明，IAA通过调节TLR 4/MyD 88信号通路来降低M1极化。为了探索IAA对M2极化的影响，研究使用IL-4诱导M2巨噬细胞。CD 206和AHR的免疫荧光染色显示，IAA以AHR依赖性方式促进M2极化（图6 F、G），表明IAA在调节巨噬细胞极化中具有双重作用。此外，当RAW264.7细胞暴露于棕榈酸联合LPS和INF以模拟高脂条件时，IAA降低了巨噬细胞的脂质摄取，进一步强调了其在缓解与AS相关的炎症和代谢紊乱中的作用。为了阐明IAA影响AS的机制，研究用IAA处理小鼠主动脉。Western blotting证实TLR 4/MyD 88/NF-κB通路和炎症因子IL-6的激活，IAA可逆转这两种通路的激活。此外，IAA可能通过AHR受体活化增强了抗炎因子（包括Arg-1和IL-10）的表达（图6 H，I）。最后，研究使用CH 223191（AHR抑制剂）干预IAA诱导的M2巨噬细胞，发现诱导被逆转。总之，这些发现强调了IAA是一种重要的微生物代谢产物，可以通过调节巨噬细胞极化和减轻炎症来减缓AS的进展。3.讨论在AS的治疗中调节肠道菌群已成为一种有前途的治疗策略。虽然研究强调了肠道菌群在AS发生中的关键作用，但对涉及的特定微生物群落及其潜在机制仍知之甚少。此外，饮食、肠道菌群和宿主代谢之间的复杂相互作用仍没有充分定义，限制了有效治疗AS的微生物和代谢靶点的确定。因此，关键微生物菌株和代谢产物的鉴定对于开发新的治疗AS的方法至关重要。TLR 4/MyD 88/NF-κB通路的激活和炎症因子IL-6的激活，而这两种激活均被IAA逆转。此外，IAA可能通过AHR受体活化增强了抗炎因子（包括Arg-1和IL-10）的表达（图6 H，I）。最后，研究使用CH 223191（AHR抑制剂）干预IAA诱导的M2巨噬细胞，发现诱导被逆转。总之，这些发现强调了IAA作为一种重要的微生物代谢产物，可以通过调节巨噬细胞极化和减轻炎症来减缓AS的进展。
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图6：MMP介导的AXL脱落信号调节的其他方面
1. B. ovatus在冠心病风险人群中的关键作用：研究发现，与ASCVD患者相比，具有冠心病风险因素的志愿者组（NP组）的肠道微生物多样性显著更高。B. ovatus在NP组中更为丰富，与ASCVD患者相比，NP组中B. ovatus的相对丰度显著更高。
2. 人类粪便微生物移植（FMT）调节Apoe-/-小鼠的AS发展：高脂饮食（HFD）喂养的Apoe-/-小鼠接受来自ASCVD患者或NP组的粪便微生物移植后，结果显示，来自NP组的FMT显著减少了系统性炎症，调节了脂质代谢，并减少了主动脉壁中的斑块形成和炎症标志物。
3. B. ovatus调节胆汁酸和脂质代谢以减轻AS：B. ovatus通过产生胆盐水解酶（BSH），将结合型胆汁酸转化为游离胆汁酸，增加胆汁酸排泄，减少肠肝循环，从而改善系统性胆固醇水平。
4. B. ovatus衍生的色氨酸代谢物IAA在减轻AS中的作用：IAA能够抑制M1型巨噬细胞的TLR4/MyD88/NF-kB信号通路，促进M2型巨噬细胞的极化，从而恢复M1和M2巨噬细胞的平衡，减少炎症反应。
研究团队对患有动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的患者和具有冠心病风险因素的志愿者的粪便和血清样本进行了全面的微生物组-代谢物分析，鉴定出核心菌株Bacteroides ovatus（B. ovatus）。发现B. ovatus作为一种第二代益生菌，能够通过恢复肠道屏障功能、改善胆汁酸和脂质代谢以及产生IAA来改善AS。该研究为未来B. ovatus在AS治疗中的应用提供了理论基础，并为相关制剂的开发提供了依据。迈维代谢提供创新的贯穿多组学解决方案，欢迎咨询。
迈维代谢在探索肠道菌群与代谢性疾病的研究中，精心打造了一套全方位的研究解决方案，累积了丰富的多组学研究项目经验。研究成果，已发表于《Nature》、《Nature Genetics》、《Nature Communications》、《Nature Metabolism》、《Gut》、《Gastroenterology》、《Aggregate》、《Circulation Research》、《Cancer Communications》、《Microbiome》、《Advanced Science》、《Engineering》以及《PNAS》等国际顶尖学术期刊之上。
来源：小朵说科学
