摘要：Wnt/β-catenin信号通路及其失调在干细胞命运决定和多种疾病的病理过程中起着至关重要的作用。然而，Wnt配体的疏水性以及其与Frizzled受体的交叉反应性，限制了其在再生医学中的应用。
Wnt/β-catenin信号通路及其失调在干细胞命运决定和多种疾病的病理过程中起着至关重要的作用。然而，Wnt配体的疏水性以及其与Frizzled受体的交叉反应性，限制了其在再生医学中的应用。
昆明医科大学类器官研究院赵冰院长团队在《Small Methods》期刊发表最新研究成果，开发了一种合成的关键受体调节剂——FZD激动剂RRP-pbFn，用于在不直接结合LRP5/6的情况下高效激活Wnt/β-catenin信号通路。
此外，还开发了一种合成的LRP拮抗剂RRP-Dkk1c，其在抑制Wnt/β-catenin信号通路活性方面比Dkk1更有效，从而在体内消除了CT26衍生的结肠癌异种移植物的形成。这两对针对细胞表面受体的关键受体调节剂在生物医学研究和潜在治疗应用中展现出巨大前景。
文章介绍
题目：合成卷曲激动剂和LRP拮抗剂在类器官培养物和体内纵Wnt/β-catenin信号转导
杂志：Small Methods
影响因子：10.7
发表时间：2025年3月
#1
研究背景
Background
Wnt/β-catenin信号通路在干细胞自我更新和谱系特异性分化中发挥关键作用，调控胚胎发育和组织稳态。该通路通过WNT与FZD受体和LRP5/6受体形成异二聚体，促进β-catenin积累并转录靶基因。Wnt激动剂被用于维持干细胞扩增和类器官的培养，特别是在药物发现和再生医学中表现出巨大的潜力。
Wnt/β-catenin信号通路的调控挑战之一是细胞内激动剂可能导致非靶向效应，产生广泛的基因表达变化。目前的替代Wnt激动剂在激活Wnt/β-catenin信号通路时存在效率较低的问题，因此有必要开发不依赖天然配体机制的合成调节剂。RNF43/ZNRF3突变失活或R-spondin融合可导致Wnt受体的异常活化，这在癌症中起到关键作用，靶向这些受体的拮抗剂有望用于治疗相关癌症。
该研究中两种合成的关键受体调节剂被开发并展示了良好的效果。FZD激动剂RRP-pbFn比传统Wnt激动剂表现出更有效的信号通路激活，支持多种类型的类器官生长和扩增，并在肝区化和肠道增殖中表现出体内功效。
LRP拮抗剂RRP-Dkk1c在抑制Wnt/β-catenin信号通路方面比天然Dkk1更有效，有助于抑制肿瘤生长。这些合成调节剂具有小分子量和水溶性，展现出巨大的应用潜力，在再生医学研究、类器官培养和癌症治疗等领域提供了新的思路，并为开发其他信号通路的调节剂提供了一个有力的策略。
#2
研究思路
Methods
这项研究开发了两种合成的关键受体调节剂，通过体外细胞实验和体内动物实验，研究其在调控Wnt/β-catenin信号通路中的作用。借助共免疫沉淀、荧光素酶报告基因分析、免疫荧光染色、qRT-PCR等技术，探讨这些调节剂对细胞信号通路的动态调控特性，揭示其在干细胞自我更新和组织再生中的关键机制，筛选出可能促进组织修复和抑制肿瘤生长的关键生物线索和分子靶点。
#3
研究结果
Results
1. 生成一种合成型FZD激动剂以高效激活Wnt/β-catenin信号通路
为了精确调控Wnt/β-catenin信号通路，开发了光控合成Wnt（sWnt）系统。通过将sWnt片段（pbF/Dkk1c）与pMag/nMag融合，构建了光遗传学工具。在HEK 293T细胞中测试后，发现单独的pMag-pbF融合蛋白能显著激活Wnt信号通路，而基于pMag/nMag的sWnt系统未能增强信号。
进一步实验显示，pMag-pbF在光照下对TOP-Flash报告基因具有显著的诱导效应，且50%的pMag-pbF条件培养基也能有效激活Wnt信号通路。值得注意的是，pMag-pbF的活性受其方向性影响，pMag融合到pbF的N端表现出更强活性。
此外，pMag-pbF与Wnt增强剂R-spondin1协同作用，进一步验证了其在Wnt信号激活中的潜力。通过构建pMag和pbF的截短变体，发现pMag(1-120)-pbF具有最强的Wnt激活效应，这一变体被命名为RRP。
通过进一步优化，RRP与pbF的N末端结构域（pbFn）组合后，表现出更强的信号激活，且在蓝光照射下效果保持稳定。突变分析表明，pMag的R52和R55残基对激动剂活性至关重要。这些合成激动剂不仅在细胞实验中表现出强大的Wnt信号激活作用，而且通过设计小分子量和优化结构，提高了其在再生医学中的潜力，展示了它们在未来研究中的应用前景（图1）。
图1 合成FZD激动剂的高效Wnt/β-catenin信号激活。
2. RRP-pbFn更有效地激活Wnt/β-catenin信号通路
接下来研究FZD激动剂RRP-pbFn是否具有激活Wnt/β-catenin信号通路的优越能力。在HEK 293T细胞中进行的剂量依赖性Wnt报告基因分析显示，RRP-pbFn即使在低浓度下，也能更强烈地激活Wnt/β-catenin信号通路，且效果不受R-spondin1的影响。
与Dkk1c-pbF相比，RRP-pbFn展现出更强的信号激活作用，且其分子量较小，这使得其在激活Wnt/β-catenin信号通路中的效能更强。此外，蛋白分析结果表明，RRP-pbFn能显著增强β-catenin的稳定性，优于Dkk1c-pbF，进一步证明其在激活Wnt/β-catenin信号通路中的优势。
总的来说，RRP-pbFn作为一种水溶性、低分子量的合成FZD激动剂，比改进型替代Wnt更有效，展示了其作为Wnt激动剂的潜力，表明靶向FZD可能是发现下一代Wnt激动剂的重要策略（图1）。
3. RRP-pbFn促进多种小鼠和人类类器官的生长
由于Wnt/β-catenin信号通路在组织干细胞自我更新中的关键作用，Wnt激动剂被广泛应用于干细胞、祖细胞及类器官的培养系统。本研究评估了RRP-pbFn作为下一代Wnt/β-catenin激动剂在支持类器官培养中的效果。
通过从多种组织（包括小鼠小肠、肺泡、胃、肝细胞和人类胆管细胞）中生成类器官，并在含有或不含重组RRP-pbFn的培养基中进行培养，研究发现小肠类器官在基础培养基中保持正常形态，而RRP-pbFn支持的类器官则表现为薄壁囊状结构，提示其具有更强的增殖能力。、
此外，RRP-pbFn显著提高了胃源性类器官的数量，并增加了肺泡、肝细胞和人类胆管细胞源性类器官的面积。这一效果与Wnt靶基因Lgr5和Axin2的转录水平增强密切相关。在胆管细胞类器官中，RRP-pbFn与Dkk1c-pbF蛋白进行比较，结果显示，RRP-pbFn显著改善了类器官的面积。总体来说，这些结果表明RRP-pbFn能够有效支持多种类器官模型的生长（图2）。
图2 RRP-pbFn促进各种小鼠和人类类器官的生长。
4. RRP-pbFn通过调控Wnt/β-catenin信号通路在体内诱导肝脏和肠道祖细胞的扩增
为了评估FZD激动剂RRP-pbFn在体内的效果，研究利用腺相关病毒8（AAV-8）作为递送系统，感染小鼠肝细胞。RRP-pbFn与小鼠IgG Fc片段融合，延长其在体内的半衰期。小鼠被注射表达RRP-pbFn-Fc的AAV-8或阴性对照的Fc，之后进行有无重组R-spondin1的联合注射。通过qRT-PCR确认AAV介导的RRP-pbFn-Fc在小鼠肝脏中的表达。
在肝脏中，WNT在中央静脉附近表达，激活Wnt/β-catenin信号通路后会触发肝细胞的基因表达程序，特别是谷氨酰胺合酶（GS）的表达，从而扰乱代谢区化。单独使用AAV-RRP-pbFn-Fc未显著影响肝脏GS表达，但与R-spondin1联合使用时，GS表达区域显著扩展。
此外，RRP-pbFn处理组相比对照小鼠，GS和Axin2表达上调，门静脉标记物Cyp2f2的mRNA表达则被抑制。在小肠中，Wnt/β-catenin信号通路的激活促进隐窝增生和Ki67+上皮细胞的增殖。通过静脉注射，AAV-8成功感染小鼠肝细胞，导致转基因产物持续分泌到循环中。AAV-RRP-pbFn-Fc感染还诱导了小肠绒毛底部区域Ki67表达的增加。
这些结果验证了RRP-pbFn在体内激活了Wnt/β-catenin信号通路，改变了肝脏的代谢区化，并诱导了肠道绒毛的增殖（图3）。
图3 RRP-pbFn通过在体内操纵Wnt/β-catenin信号通路，诱导肝脏和肠道祖细胞的扩张。
5. RRP-pbFn不与LRP结合，但触发FZD-LRP相互作用以激活Wnt/β-catenin信号通路
本研究探讨了RRP-pbFn通过FZD受体激活Wnt/β-catenin信号通路的机制。通过免疫共沉淀实验，发现LRP5和LRP6的胞外段（LRP5E1E4、LRP6E1E4）与sWnt发生相互作用，但不与RRP-pbFn结合，这表明RRP-pbFn激活Wnt信号通路并不依赖于与LRP5/6受体的结合。
此外，RRP-pbFn与FZD5和FZD7的相互作用较强，而与FZD1的相互作用较弱，提示其通过靶向特定的FZD受体来激活Wnt信号通路。通过使用shRNA抑制LRP5/6的表达，发现LRP5/6的敲低显著抑制了RRP-pbFn或sWnt诱导的Wnt反应，进一步证明LRP5/6在该过程中的关键作用。
过表达Dkk1c实验显示，Dkk1c不仅抑制了sWnt诱导的Wnt信号通路激活，也抑制了RRP-pbFn的激活效果。进一步过表达LRP5和LRP6的胞外段，发现减弱内源性FZD与LRP5/6之间的相互作用同样抑制了RRP-pbFn或sWnt诱导的Wnt信号通路激活。
对于LRP6磷酸化的分析显示，RRP-pbFn诱导的LRP6磷酸化比sWnt更强，表明FZD-LRP的相互作用在RRP-pbFn激活Wnt/β-catenin信号通路中起重要作用。通过氨基酸替换实验，发现带正电荷的精氨酸残基的替换显著增强了RRP-pbFn的Wnt激活能力，而其他氨基酸的替换则没有类似效果。与R-spondin1不同，RRP-pbFn或sWnt并未改变FZD7的蛋白水平，表明RRP-pbFn激活Wnt信号通路的机制不同于R-spondin1。
最后通过对Smo、TGF-β和Yap等信号通路的检测，发现pMag、pMag-pbF或RRP-pbFn并未激活这些通路。综合来看，RRP-pbFn通过与特定类型的FZD受体相互作用，而不是通过LRP5/6受体结合，激活Wnt/β-catenin信号通路（图4）。
图4 RRP-pbFn不与LRP结合，但触发FZD-LRP相互作用以激活Wnt/β-catenin信号通路。
6. 通过将RRP与Dkk1c融合生成高效的LRP拮抗剂
研究表明，RRP(R52I)-pbFn可以抑制RRP-pbFn诱导的Wnt/β-catenin信号通路的激活，并且在对抗sWnt诱导的Wnt/β-catenin信号通路激活时，RRP(R52I)-pbFn显示出适度的拮抗效应。
为了开发一种更有效的合成拮抗剂，研究者将pbFn替换为与LRP5/6受体具有高亲和力的Dkk1或Dkk1c。考虑到FZD受体的冗余性以及pbFn对特定FZD受体的结合特性，这一策略显得尤为合理。
实验结果表明，Dkk1和Dkk1c均能部分阻断sWnt诱导的Wnt信号反应，无论是否添加R-spondin1。RRP-Dkk1显示出更强的抑制作用，而RRP-Dkk1c完全抑制了Wnt/β-catenin信号通路的激活，抑制效果可将其降至5%以下。
与RRP(R52I)-pbFn相比，RRP-Dkk1c表现出更优越的抑制活性。进一步的突变实验发现，RRP(R52I)-Dkk1c和RRP(R55M)-Dkk1c均能有效抑制sWnt诱导的Wnt/β-catenin信号通路激活，表明RRP在与pbFn和Dkk1c融合时发挥了不同的调节作用（图5）。
7. RRP-Dkk1c比现有的LRP拮抗剂具有更强的Wnt/β-catenin信号通路抑制能力
研究比较了Dkk1与RRP-Dkk1c在抑制Wnt/β-catenin信号通路激活方面的效能。通过Wnt报告基因分析，在HEK 293T细胞中，RRP-Dkk1c展现出比Dkk1更强的抑制作用，能够有效阻断由sWnt诱导的Wnt/β-catenin信号通路的激活，并且RRP-Dkk1c的分子量较小。
进一步评估RRP-Dkk1c在类器官生长中的功能，发现将小鼠肠道类器官与重组RRP-Dkk1c共培养后，类器官的活性显著降低。此外，将小鼠胃源性类器官、肺泡、肝细胞以及人类胆管细胞源性类器官与RRP-Dkk1c共同培养，结果显示类器官数量减少，且Wnt靶基因Lgr5和Axin2的mRNA水平显著下调。
这些结果表明，合成LRP拮抗剂RRP-Dkk1c能够有效抑制多种类器官模型中的生长，并显著降低Wnt靶基因的表达，为其作为类器官生长抑制剂提供了有力的证据（图5）。
图5 合成LRP拮抗剂RRP-Dkk1c是一种更有效的Wnt/β-catenin信号抑制剂。
8. RRP-Dkk1c消除了CT26衍生的结肠癌异种移植的形成
研究通过分析人类蛋白质图谱数据集中595名结直肠癌患者的Kaplan-Meier曲线，发现高Dkk1表达（n=455）与更高的生存率显著相关，提示Dkk1在Wnt/β-catenin信号通路中的抑制作用与结直肠癌患者的生存率提高相关。
为了评估RRP-Dkk1c作为肿瘤生长抑制剂的潜力，研究者建立了异种移植小鼠模型，皮下注射稳定表达CT26细胞，这些细胞在体外快速增殖。CT26细胞系为缺乏Apc突变的未分化结肠癌细胞系，是研究RRP-Dkk1c效应的理想模型。通过慢病毒介导的感染，筛选出稳定表达RRP-Dkk1c-Fc或对照Fc的CT26细胞。
集落形成实验显示，稳定表达RRP-Dkk1c-Fc的CT26细胞相比对照细胞，其集落生长显著受抑制，第七次传代后，RRP-Dkk1c-Fc细胞的计数为1.88×10^10，而对照细胞为3.24×10^10。
进一步体内实验表明，注射5.0×10^5个对照细胞的小鼠可形成肿瘤，而注射稳定表达RRP-Dkk1c-Fc的CT26细胞的小鼠未出现肿瘤。这些结果表明，RRP-Dkk1c在抑制结肠癌肿瘤生长方面具有显著的潜力（图6）。
图6 RRP-Dkk1c消除CT26来源的结肠癌异种移植的形成。
小结
本研究开发了两种合成受体调节剂RRP-pbFn和RRP-Dkk1c，分别高效激活和抑制Wnt/β-catenin信号通路。RRP-pbFn显著促进多种类器官生长和体内组织再生，而RRP-Dkk1c在抑制肿瘤生长方面表现出色。这些调节剂为深入研究Wnt信号通路及开发新型治疗策略提供了有力工具。
参考文献
Dai Q, Wang J, Lin Z, Yu D, Yang H, Wei J, Li X, Hu H, Ni C, Zhao B. Manipulation of Wnt/β-Catenin Signaling by Synthetic Frizzled Agonist and LRP Antagonist in Organoid Cultures and In Vivo. Small Methods. 2025 Mar 28:e2500425. doi: 10.1002/smtd.202500425.
来源：培养盒守护者