摘要：ChIP是一种强大的工具，它使用分离的染色质和针对目标抗原的抗体来确定目标是否与特定的DNA序列结合或绘制整个基因组的分布图（ChIP-seq）。
ChIP是一种强大的工具，它使用分离的染色质和针对目标抗原的抗体来确定目标是否与特定的DNA序列结合或绘制整个基因组的分布图（ChIP-seq）。
双交联染色质免疫沉淀（Dual Cross-linking ChIP）是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的技术，通过使用两种交联剂（如甲醛和EGS或DSG）来固定蛋白质与DNA之间的相互作用，从而提高实验的稳定性和分辨率。
该方案使用甲醛和EGS（乙二醇双（琥珀酰亚胺基琥珀酸酯））将蛋白质与DNA双交联，以便有效地将转录因子与染色质样本中的DNA结合。这种双交联方式对于观察与DNA直接结合，或复合物中未直接与DNA结合的转录因子的结合模式非常有效。
所需试剂配方
（1）ChIP 缓冲液
50 mM HEPES-KOH pH7.5
140 mM NaCl
1 mM EDTA pH8
1% Triton X-100
0.1% 脱氧胆酸钠
0.1% SDS
蛋白酶抑制剂（现用现加）
（2）RIPA 缓冲液
50 mM Tris-HCl pH8
150 mM NaCl
2 mM EDTA pH8
1% NP-40
0.5%脱氧胆酸钠
0.1% SDS
蛋白酶抑制剂（现用现加）
（3）洗涤缓冲液
2 mM EDTA
20 mM Tris-HCl pH 8.0
150 mM NaCl
0.1% SDS
1% Triton X-100
（4）TE 缓冲液
10 mM Tris pH 8.0
1 mM EDTA
（5）洗脱缓冲液
1% SDS
100 mM NaHCO3
第 1 阶段 交联处理
交联是一个与时间相关的过程，需要进行优化。我们建议使用EGS对样品进行 20 - 30分钟的交联，并结合10分钟的甲醛处理。
实验步骤
1.首先准备两个150 cm2长满细胞的培养皿，每个培养皿有 1 × 107 - 5 × 107个细胞。往每个培养皿中添加20 mL冰冷PBS，并添加300 mM EGS，至终浓度为1.5 mM。
2.在室温下轻轻旋转30分钟，促使蛋白质与DNA交联。
注意：交联时间不宜过长，过度交联表位也可能被掩盖，降低抗原的可及性和超声处理效率。
3.在通风橱中，向每个烧瓶中添加37%甲醛，直至最终稀释度。如果是研究组蛋白，那终浓度稀释至0.75%，如果是转录因子，终浓度稀释至1%。
4.在室温下轻轻旋转10分钟（此时间需要针对不同细胞类型进行优化）。
注意：
针对不同细胞类型，所需时间会有差异，需要进一步优化。
因甲醛有毒，需要在通风橱中进行操作。
5.在通风橱中，向培养基中加入1.5 mL 2.5 M甘氨酸（最终浓度为 125 mM），摇动孵育5分钟，以淬灭甲醛。
6.用10 mL冷PBS冲洗细胞两次。
7.加入5 mL冷PBS，用细胞刮刀彻底刮擦培养皿，并将细胞转移到50 mL离心管中。
8.重新往培养皿中加入3 mL PBS，再次刮擦，并将剩余的细胞也转移到50 mL离心管中。
9.在4℃下，以1,000 × g离心5分钟。
10.小心地吸出上清液。并用ChIP裂解缓冲液重悬细胞沉淀，大约每1 × 107个细胞添加750 μ L ChIP裂解缓冲液，置于冰上孵育10分钟。
第 2 阶段 超声波处理
实验步骤
1.对裂解物进行超声处理，将DNA剪切成平均片段大小为 200 - 1000 bp的片段。
注意：不同细胞系的超声时间不同，需要根据实际情况优化。可以在超声处理过程中，间隔一段时间取出样本测定片段大小，来确定最佳处理时间。
2.超声处理后，在4℃下以8,000 × g的速度离10分钟，沉淀细胞碎片。将上清液转移到新管中。
3.从每个超声处理过的样品中取出50 μL，测定DNA浓度和片段大小。
第 3 阶段 确定 DNA 浓度和片段大小
实验步骤
1.将70 μL洗脱液添加到50 μ L染色质中。加入4.8 µL 5 M NaCl和2 µL 10 mg/mL的RNase A。65℃下振荡孵育过夜。
2.加入2 µL 20 mg/mL蛋白酶K，60℃下振荡孵育1小时。用于破坏蛋白质和 DNA之间的交联，有助于DNA纯化。
3.使用PCR纯化试剂盒或苯酚：氯仿提取法纯化DNA。
4.取5 µL纯化的DNA添加到含有995 μL TE的EP管中，用于读取OD260，测定DNA浓度。
DNA浓度（单位：µg/mL）等于OD260数值 × 10,000。
DNA片段大小可以通过1.5%琼脂糖凝胶测定。
第4阶段 免疫沉淀
实验步骤
1.制备好的染色质，按1:10的比例稀释到RIPA缓冲液中。预留好实验组和对照组样品。建议每个IP使用约25 μ g DNA。取出50 μL染色质作为Input，使用前将其储存在-20℃。
2.除了仅含磁珠的对照组之外，其他所有样品组中添加适量一抗，并在4℃下旋转1小时。
通常情况下，每25 μg DNA添加1-10 μg抗体效果很好。
磁珠应使用蛋白A磁珠、蛋白G磁珠或两者的混合物。
3.蛋白A/G磁珠的制备。
3.1如果同时使用蛋白A和蛋白G磁珠，则混合等体积的蛋白A和蛋白G磁珠，并在RIPA缓冲液中洗涤三次。
3.2吸出RIPA 缓冲液并添加鲱鱼精子DNA至磁珠最终浓度为75 ng/ μL，并添加BSA至磁珠最终浓度为 0.1 μg/μL。
3.3添加RIPA缓冲液至磁珠体积翻倍，并在室温下旋转孵育30分钟。
3.4用RIPA缓冲液清洗一次，并添加RIPA缓冲液至磁珠体积的两倍。
4.向所有样品中加入60 μL封闭的Protein A/G Beads，4 ℃旋转IP过夜。
5.将免疫沉淀样品以 2,000 × g 的速度离心1分钟，并除去上清液。
6.用洗涤缓冲液洗涤，每次2000 × g离心1分钟，并去除上清液。重复两次。
第 5 阶段 洗脱和逆转交联
实验步骤
1.添加120 μ L洗脱缓冲液到蛋白A/G磁珠中，30℃下缓慢涡旋15分钟，洗脱DNA。
2. 2,000 × g离心1分钟，将上清液转移至新管中。
3.加入4.8 µL 5 M NaCl和2 µL 10 mg/mL RNase A，65℃振荡孵育过夜。
4.加入2 µL20 mg/mL蛋白酶K，60℃振荡孵育1小时。
5.可以使用PCR纯化试剂盒或苯酚：氯仿提取法纯化DNA。
6.通过实时PCR定量测定DNA水平。
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来源：晓晨论科技