单细胞分析VEGFA+中性粒细胞，结合机器学习建模并识别关键基因

摘要：中性粒细胞在肿瘤微环境中起关键作用，但在胶质母细胞瘤（GBM）中的功能研究不足。本研究分析 127 例异柠檬酸脱氢酶（IDH）野生型 GBM 样本的单细胞 RNA 测序数据，鉴定出 GBM 相关中性粒细胞（GBMAN）的 4 种亚型。其中，VEGFA+GBMA

01文章信息

发表杂志名称：Biology Direct

中文标题：大规模bulk和单细胞 RNA 测序结合机器学习揭示胶质母细胞瘤相关中性粒细胞的异质性并建立 VEGFA + 中性粒细胞预后模型

英文标题：Large-scale bulk and single-cell RNA sequencing combined with machine learning reveals glioblastoma-associated neutrophil heterogeneity and establishes a VEGFA+ neutrophil prognostic model

影响因子：5.7

发表日期：2025 年 4 月 5 日

01研究概述

中性粒细胞在肿瘤微环境中起关键作用，但在胶质母细胞瘤（GBM）中的功能研究不足。本研究分析 127 例异柠檬酸脱氢酶（IDH）野生型 GBM 样本的单细胞 RNA 测序数据，鉴定出 GBM 相关中性粒细胞（GBMAN）的 4 种亚型。其中，VEGFA+GBMAN 炎症反应特征减弱，与基质细胞相互作用增强，且各亚型转录调控存在显著差异。通过机器学习开发的 “VEGFA + 中性粒细胞相关特征”（VNRS）风险模型，准确性高于以往模型，是独立的预后因素。高低风险组在免疫治疗反应、肿瘤微环境相互作用和化疗疗效上差异显著。本研究有助于理解 GBMAN 的组成和特征，VNRS 模型可评估 GBM 风险并指导临床治疗。

研究结果

GBMAN 四种主要亚群的组成：

作者收集 9 个数据集的原发性和复发性 IDH 野生型 GBM 样本的 scRNA-seq 数据，经质控和消除批次效应后，整合 498,747 个细胞的转录组数据。降维聚类后，鉴定出 15 种细胞类型，进一步分析肿瘤相关中性粒细胞（TAN），确定 4 种 GBMAN 亚型：MNDA+GBMAN、LGALS1+GBMAN、ADM+GBMAN 和 VEGFA+GBMAN。ROGUE 评分显示各亚型纯度高，相关性分析表明 MNDA+GBMAN 与 LGALS1+GBMAN、ADM+GBMAN 与 VEGFA+GBMAN 特征相似。此外，复发性患者中 MNDA+GBMAN 比例显著下降，VEGFA+GBMAN 比例明显上升（图 1A-G）。本部分明确了 GBM 微环境中存在 4 种中性粒细胞亚型，且 VEGFA+GBMAN 在复发性样本中更突出。

GBMAN 的发育轨迹特征：

作者使用扩散映射和 Palantir 算法分析原发性 TAN，发现中性粒细胞从 MNDA+GBMAN 逐渐发育为 VEGFA+GBMAN，ADM+GBMAN 也有显著分化潜力，Cytotrace2 算法证实 MNDA+GBMAN 分化为 VEGFA+GBMAN 时干性得分降低。通过 ssGSEA 算法发现 VEGFA+GBMAN 的 N2 评分更高，基因富集分析揭示中性粒细胞功能从参与防御和免疫反应，逐渐转变为细胞迁移、白细胞迁移并呈现缺氧特征。对分化潜力曲线求一阶和二阶导数，确定了中性粒细胞分化的关键时间点。此外，随着缺氧和糖酵解增加，干扰素 -γ 和炎症反应先升后降（图 2A-H）。这部分揭示了 GBMAN 的发育轨迹及功能变化，表明其在发育过程中逐渐从促炎转变为免疫抑制。

GBMAN 亚群与其他细胞间的细胞通讯和细胞因子介导的转化：

作者利用免疫因子反应数据进行矩阵相似性分析，发现 ADM+GBMAN 形成主要受 IL18 和 IL36a 等刺激，VEGFA+GBMAN 主要由 IL1a、IL1b、IL18 和 TNFa 触发。CellChat 分析显示所有 GBMAN 亚群与基质细胞相互作用更强，原发性样本的信号强度高于复发性样本。在 MNDA+GBMAN 向 VEGFA+GBMAN 分化过程中，不同细胞间的受体-配体轴发生变化。进一步整合细胞间和细胞内网络分析发现，VEGFA+GBMAN 通过多种配体影响 ITGB1 等，进而影响肿瘤细胞和基质细胞的功能（图 3A-F）。该部分阐述了 GBMAN 与其他细胞的相互作用机制，明确了 VEGFA+GBMAN 在促进肿瘤发展中的作用。

GBMAN 亚型基因调控网络的综合图谱：

作者评估不同 GBMAN 亚型的基因组稳定性，发现从 MNDA+GBMAN 到 VEGFA+GBMAN 基因组不稳定性逐渐降低。SCENIC 分析和 PCA 显示各亚型转录调控特征存在差异，并确定了各亚型在原发性和复发性样本中的特定转录因子（TF）。GSEA 分析表明不同亚型在原发性和复发性阶段的基因调控网络存在显著差异，各亚型的 TF 调控不同的信号通路（图 4A-G）。此部分揭示了 GBMAN 亚型基因调控网络的差异，为理解其功能多样性提供了依据。

VNRS 预测模型的开发与评估：

基于 VEGFA+GBMAN 的免疫抑制特征，作者构建 VNRS 模型。通过单变量 Cox 回归分析确定 67 个与预后相关的基因，利用 117 种机器学习算法组合进行留一法交叉验证，最终确定最优模型。该模型在多个队列中表现出良好的预测能力，高风险组患者预后明显较差（图 5A-E）。这表明 VNRS 模型具有较强的预测能力和稳健性。

VNRS 模型与已发表预测模型的优越性验证：

作者将 VNRS 模型与 95 个已发表的胶质瘤相关预测模型进行比较，结果显示 VNRS 模型在所有队列中均与不良预后显著相关，且在 C-index 和 1 - 3 年 AUC 值方面表现优异，优于其他模型（图 6A-E）。这证明了 VNRS 模型具有更高的预测准确性和泛化能力。

高 VNRS 风险 GBM 中的免疫浸润和检查点激活：

作者利用 ESTIMATE 算法等评估 VNRS 模型预测肿瘤免疫浸润的能力，发现高 VNRS 风险评分的 GBM 免疫细胞浸润程度更高，但肿瘤纯度更低。进一步分析发现，高风险组中免疫抑制性细胞增加，免疫检查点活性升高，且模型基因与免疫检查点基因表达相关性强（图 7A-H）。这表明 VNRS 模型可用于预测肿瘤发生和免疫抑制，高风险组患者可能对免疫检查点抑制剂治疗更敏感。

通过 VNRS 模型进行稳健的预后评估和治疗洞察：

作者使用 timigp 方法发现，在高风险组中，中性粒细胞是导致预后不良的重要因素，而在低风险组中则是有益细胞类型。高风险组的代谢模式有利于肿瘤生长、侵袭和转移，且对化疗药物耐药性更强。药物敏感性分析显示，Ribociclib 等药物在高风险组中敏感性增强（图 8A-G）。这说明 VNRS 模型能有效评估 GBM 患者中性粒细胞的免疫功能，为治疗提供指导。

VNRS 模型基因在 RNA 和蛋白质水平的表达验证：

作者利用 TCGA 和 GTEx 数据集验证 VNRS 模型基因在 GBM 和低级别胶质瘤（LGG）中的表达，发现部分基因在肿瘤样本中高表达，部分基因低表达。免疫组化结果也证实了这些基因在蛋白质水平的表达差异（图 9A-L）。这为 VNRS 模型的应用提供了更有力的证据。

本研究利用大规模 scRNA-seq 技术对 GBM 相关中性粒细胞（GBMAN）进行分析，鉴定出 4 种亚型，明确了其发育轨迹、细胞通讯模式和基因调控网络。重点研究了 VEGFA+GBMAN 在促进免疫抑制性肿瘤微环境中的作用。通过机器学习构建的 VNRS 模型在预测 GBM 患者预后方面表现优异，可作为独立预后因素，评估免疫治疗反应和化疗疗效。研究揭示了 GBMAN 亚群的转录差异和功能多样性，为 GBM 的免疫治疗提供了新视角和策略，VNRS 模型有望指导 GBM 的个性化治疗，改善患者预后。

文章综合运用多种前沿技术和方法，对胶质母细胞瘤相关中性粒细胞展开深入研究，具体如下：

数据来源

：从多个公共数据库获取数据，包括 9 个数据集的 127 例 IDH 野生型胶质母细胞瘤（GBM）患者的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据，以及来自其他数据库的批量 RNA-seq 和微阵列数据。

数据处理与分析

scRNA-seq 数据处理和整合

：统一参考基因组为 hg38，对数据进行预处理，包括过滤低质量细胞、批次效应校正等，使用多种算法进行降维、聚类分析。

细胞注释

：依据聚类结果和标记基因表达确定细胞类型。

评估 GBMAN 子集纯度

：运用 ROGUE 包评估 GBMAN 异质性。

轨迹分析

：借助 CytoTRACE2 和 Palantir 等工具研究中性粒细胞亚群的发育轨迹。