摘要：张嘉祺, 刘雯雯, 王茜婷, 等. 甲基转移酶样3对巨核细胞系花生四烯酸代谢通路的影响和机制[J]. 中国心血管杂志, 2025, 30(1)：75-85. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5410.2025.01.013.
中国心血管杂志
2025
Chinese JouRNAl of Cardiovascular Medicine本刊为北大《中文核心期刊要目总览》2023年版入编期刊、科技期刊世界影响力指数（WJCI）报告2024收录期刊、中国科技核心期刊、武大（RCCSE）核心期刊，欢迎来稿！
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甲基转移酶样3对巨核细胞系花生四烯酸
代谢通路的影响和机制
Impact and mechanism of methyltransferase-like 3 on regulation of arachidonic acid metabolism in megakaryocytic lines
张嘉祺 刘雯雯 王茜婷 陈夏欢 刘梅林
作者单位：100034 北京大学第一医院老年病内科
通信作者：刘梅林，电子信箱：liumeilin@hotmail.com
引用本文：
张嘉祺, 刘雯雯, 王茜婷, 等. 甲基转移酶样3对巨核细胞系花生四烯酸代谢通路的影响和机制[J]. 中国心血管杂志, 2025, 30(1)：75-85. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5410.2025.01.013.
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摘
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要
目的
探讨甲基转移酶样3(METTL3)对人成巨核细胞白血病细胞(MEG-01)花生四烯酸(AA)代谢通路的影响和相关机制。
方法
构建METTL3差异表达的MEG-01，分为正常对照(Blank)组、METTL3过表达(OE)组和过表达阴性对照(OE-NC)组、METTL3敲低(KD)组和敲低阴性对照(KD-NC)组。采用定量聚合酶链反应(qPCR)法和免疫印迹(Western blot)法检测各组METTL3、YTH结构域家族蛋白(YTHDF1、YTHDF2)以及参与AA代谢的关键基因前列腺素内过氧化物合酶1/环氧合酶-1(PTGS1/COX-1)、前列腺素内过氧化物合酶2/环氧合酶-2(PTGS2/COX-2)、血栓素A合酶1(TBXAS1)、前列腺素I2合酶(PTGIS)和前列腺素I22222)的水平。采用蛋白稳定性实验和RNA结合蛋白质免疫沉淀(RIP)实验验证YTHDF1与COX-1 mRNA的结合情况。结果
qPCR和Western blot检测显示，OE组YTHDF1、PTGS1/COX-1的mRNA和蛋白水平较OE-NC组升高，KD组较KD-NC组降低(均为P222的含量低于KD-NC组(均为P结论
METTL3可能通过促进N6-甲基腺苷(m6A)修饰介导的COX-1 mRNA翻译效率，调控巨核细胞系的AA代谢通路。
心血管疾病是威胁人类健康的主要疾病，由于其高发病率、高死亡率和治疗复杂性，对公共卫生系统构成严峻挑战[1]。阿司匹林是预防心血管疾病应用最广泛的抗血小板药物，能够抑制血小板聚集，显著降低心脑血管事件，改善生存和生活质量。然而部分患者服用阿司匹林后无法达到预期的抗血小板治疗效果，提示阿司匹林的抗血小板作用存在个体差异[2]。因此，关注阿司匹林疗效不佳的问题，探索其可能存在的机制具有重要的临床价值。阿司匹林主要作用于环氧合酶-1(cyclooxygenase-1，COX-1)，干扰花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代谢而发挥抗血小板作用[3]。巨核细胞是血小板的前体细胞，人成巨核细胞白血病细胞系MEG-01是体外实验中最常用于血小板功能研究的替代细胞系[4]。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)是真核细胞最丰富的核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)修饰形式。既往研究显示，RNA m6A甲基化修饰广泛参与动脉粥样硬化、心肌缺血、心肌肥厚、心力衰竭和高血压等疾病的发生与进展，为心血管疾病研究提供新的靶点和治疗思路[5]。甲基转移酶样3(methyltransferase-like 3，METTL3)是甲基转移酶复合物中的核心组分，在m6A修饰中扮演重要的角色[6]。本课题组前期研究[7]发现，阿司匹林低反应组全血RNA m6A甲基化水平、METTL3和YTH结构域家族蛋白1(YTH domain family protein 1，YTHDF1)的mRNA水平明显高于高反应组，提示RNA m6A甲基化修饰水平与阿司匹林反应性相关，METTL3和YTHDF1可能通过干扰AA代谢通路关键基因转录后调控，影响阿司匹林反应性。本研究通过构建METTL3差异表达的MEG-01细胞模型，检测AA代谢通路关键基因的表达水平，探索METTL3对巨核细胞系AA代谢通路的影响和潜在机制。01 材料与方法
Part 1
主要试剂和仪器
MEG-01细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)；过表达慢病毒、RNA干扰(RNAi)-Easy慢病毒(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)；RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS(美国Gibico公司)；佛波酯(美国Sigma公司)；无水乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿(美国Mreda公司)；RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)引物(北京天一辉远生物科技有限公司)；逆转录试剂盒(日本Takara公司)；SYBRTM Master Mix(美国Applied Biosystems公司)；β-Tubulin抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；METTL3、YTHDF1、YTHDF2、COX-1、COX-2、血栓素A合成酶1(thromboxane A synthase 1，TBXAS1)抗体、血栓素B2(thromboxane B222)ELISA试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)；放线菌酮(美国MCE公司)；RNA结合蛋白质免疫沉淀(RNA-binding protein immunoprecipitation，RIP)实验试剂盒(广州伯信生物科技有限公司)。Part 2
细胞培养与诱导分化
本研究为细胞实验，MEG-01细胞为巨核细胞研究成熟的细胞系，不包含人体和动物实验，不涉及伦理问题。将MEG-01细胞置于含有10%胎牛血清、链霉素和青霉素的RPMI-1640培养基中，在37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。MEG-01细胞为悬浮细胞，根据生长情况一般培养2～3 d后，采用离心法(生长较慢时)和半吸半弃法(生长较快时)进行换液和传代。MEG-01经佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)诱导后可分化为成熟的巨核细胞，表面表达CD41和CD61，更接近血小板功能研究的状态。本实验采用诱导分化后的MEG-01细胞进行实验。将1 mg的PMA溶解于1 ml二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，溶解混匀之后配置成1 mg/ml浓度的PMA溶液(－20℃避光储存)。使用不含血清的1640培养基稀释PMA溶液，配置成1 000 ng/ml浓度的PMA工作液，现配现用。采用流式细胞术和定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)法，分别检测不同浓度、不同时长PMA工作液处理后细胞表面标志物CD41和CD61的表达量，初步确定PMA诱导的最佳浓度和时间。将在PMA诱导分化后的MEG-01细胞用瑞士染色法染色，显微镜下观察最佳浓度和时间诱导后的细胞形态，进一步确认巨核细胞经PMA诱导分化是否成功。
Part 3
慢病毒感染
用于MEG-01细胞METTL3干预的过表达和RNAi慢病毒，按照慢病毒感染使用手册进行标准化操作。将MEG-01细胞分为5组：正常对照(Blank)组、METTL3过表达(OE)组和过表达阴性对照(OE-NC)组、METTL3敲低(KD)组和敲低阴性对照(KD-NC)组。细胞在正常条件下培养24 h后，以1×108TU/ml的病毒浓度进行感染。感染48 h后，使用荧光显微镜观察荧光表达丰度，并通过qPCR验证感染效率以验证实验结果。Part 4
RNA提取和实时荧光qPCR检测
采用RNA提取试剂盒提取细胞RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA。使用NCBI的Primer Designing Tool进行在线引物设计，以GAPDH作为内参。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。本研究所选用的基因PCR扩增引物序列如表1所示。使用由10 μl 2×SYBR Green Master Mix、正反向引物各0.5 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 8 μl组成的20 μl反应体系在快速实时PCR仪上进行实时荧光qPCR。使用2－ΔΔCT法计算目的基因mRNA相对表达量。表1 实时荧光qPCR反应引物序列和产物长度
Part 5
蛋白提取和免疫印迹(Western blot)实验
使用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液从细胞中提取蛋白，通过二喹啉甲酸法(BCA)测定蛋白质浓度。各组蛋白上样后使用10% SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，随后通过转膜将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。使用快速封闭液封闭后，加入一抗METTL3、YTHDF1、YTHDF2、COX-1、COX-2、TBXAS1和内参β-Tubulin，4℃孵育过夜。次日用TBST洗涤3次后加入二抗，室温孵育1 h，再用TBST洗涤1次。最后，将PVDF膜浸入发光液中1 min，放入凝胶成像系统成像，并使用ImageJ软件进行定量分析。
Part 6
ELISA检测
利用ELISA检测试剂盒，按照说明书配制相关溶液，用酶标仪读取450 nm下各孔的吸光度值。根据标准品的浓度和吸光度值绘制标准曲线，计算各组细胞培养上清中的PGH22含量。Part 7
蛋白稳定性实验
分别向Blank、OE、OE-NC、KD和KD-NC组细胞中加入mRNA翻译抑制剂放线菌酮(cycloheximide，CHX)，使各组培养基中CHX浓度为100 μg/ml。在各组对应的对照组加入等体积的PBS，培养24 h后，提取蛋白进行Western blot实验检测各组中蛋白表达情况。
Part 8
RIP实验
按照RIP试剂盒说明书进行实验。将各组细胞分为加入YTHDF1抗体的IP亚组、加入阴性对照IgG的IgG亚组以及不作处理的Input亚组。经过细胞裂解、去除DNA、平衡磁珠和免疫沉淀等步骤，使用苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)提取免疫沉淀的RNA，并通过qPCR法测定各组及各亚组中COX-1 mRNA表达。
Part 9
统计学方法
采用SPSS 26.0软件进行统计分析。首先使用Shapiro- Wilk法对计量资料进行正态性检验，对于符合正态分布的计量资料用M±SD表示，两组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料用M(Q13)表示，两组间比较采用非参数Mann- Whitney U检验。P02
结果
Part 1
MEG-01细胞诱导分化为成熟巨核细胞验证
2.1.1 诱导分化前后显微镜下MEG-01细胞形态
诱导分化前的MEG-01细胞形态与原始巨核细胞相似，一般呈圆形或不规则形，体积较大，核仁呈圆形，细胞质与胞质内颗粒较少，在培养皿中可呈分散或聚集悬浮生长；诱导分化后的MEG-01细胞形态与产血小板型巨核细胞相似，体积增大呈长条形，细胞膜不清晰呈伪足状，细胞质与胞质内颗粒增多，细胞核不规则呈分叶状，在培养皿中半贴壁生长。镜下形态如图1所示。
注：PMA，佛波酯；MEG-01，巨核细胞白血病细胞系；A.MEG-01细胞镜下形态；B.MEG-01细胞20 ng/ml PMA处理3 d镜下形态；C.MEG-01细胞瑞氏染色后镜下形态；D.MEG-01细胞20 ng/ml PMA处理3 d瑞氏染色后镜下形态；普通光学显微镜下观察并记录图像(×100)
图1 PMA诱导前后MEG-01细胞镜下形态
2.1.2 不同浓度PMA处理后MEG-01细胞表面CD41和CD61表达
采用流式细胞术检测不同浓度(0、1、5、10、15、20、40、60、80、100、200和400 ng/ml)PMA诱导下细胞表面CD41和CD61表达，如图2、图3、表2所示，20 ng/ml PMA诱导条件下MEG-01细胞表面CD41和CD61表达量最高。
图2 不同浓度PMA处理后MEG-01细胞表面CD41表达
图3 不同浓度PMA处理后MEG-01细胞表面CD61表达
表2 不同浓度PMA处理后MEG-01细胞表面CD41和CD61表达(%)
注：PMA，佛波酯；MEG-01，巨核细胞白血病细胞系
2.1.3 PMA处理不同时间后MEG-01细胞表面CD41和CD61表达
采用流式细胞术检测相同浓度20 ng/ml PMA诱导不同时间(1、2、3、4、5、6、7和10 d)后细胞表面CD41和CD61表达，如图4、图5、表3所示，20 ng/ml PMA诱导3 d条件下MEG-01细胞表面CD41和CD61表达量最高。
图4 20 ng/ml PMA处理不同时间后MEG-01细胞表面CD41表达
图5 20 ng/ml PMA处理不同时间后MEG-01细胞表面CD61表达
表3 20 ng/ml PMA处理不同时间后MEG-01细胞表面CD41和CD61表达(%)
2.1.4 PMA处理MEG-01细胞诱导分化的最佳条件
采用20 ng/ml PMA处理MEG-01细胞3 d，提取细胞RNA，qPCR法检测处理和未处理细胞中CD41和CD61 mRNA表达量，与未处理的MEG-01细胞相比，最佳条件PMA处理后细胞CD41和CD61 mRNA表达量明显升高，差异有统计学意义(均为P图6。
图6 MEG-01细胞诱导前后CD41和CD61 mRNA表达水平比较
Part 2
METTL3对AA代谢通路关键基因COX-1表达的影响
采用qPCR法和Western blot法检测干预METTL3表达后各组AA代谢通路关键基因mRNA和蛋白水平的变化，研究METTL3对AA代谢通路关键基因表达的影响。结果如图7A和图7B所示，OE组YTHDF1、PTGS1/COX-1的mRNA和蛋白水平较OE-NC组明显升高，KD组YTHDF1、PTGS1/COX-1的mRNA和蛋白水平较KD-NC组明显降低(均为PP>0.05)。
图7 METTL3对AA代谢通路关键基因的影响
Part 3
METTL3对AA代谢通路产物PGH2222222的相对含量低于KD-NC组(均为P22的含量比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。以上结果提示METTL3过表达后YTHDF1同时上调，COX-1表达量增加从而导致AA代谢通路产物PGH22增多。Part 4
METTL3通过YTHDF1促进COX-1 mRNA的翻译
在蛋白稳定性实验中，通过加入mRNA翻译抑制剂CHX后，过表达METTL3不能明显增加COX-1的蛋白水平(P>0.05)。由该结果推测METTL3可能通过影响COX-1 mRNA的翻译从而进一步调控COX-1蛋白水平的表达，见图8A。
结合蛋白YTHDF1可与翻译起始复合物直接作用，从而促进翻译效率。进一步研究发现，如果仅过表达METTL3可明显增加COX-1蛋白水平(PPP>0.05)。由此结果证实，结合蛋白YTHDF1可能参与了COX-1 mRNA的翻译调控，见图8B。
在RIP实验中，各组加入YTHDF1抗体的IP亚组COX-1 mRNA相对含量显著高于对照IgG亚组(PPP图8C。
图8 METTL3通过YTHDF1促进COX-1 mRNA的翻译
03
讨论
心血管疾病是全球范围内人类健康的主要威胁，血栓形成在心血管疾病的发生和发展中起着关键作用[8]。阿司匹林作为抗血小板治疗的基石药物，在临床中广泛应用，但其疗效存在显著的个体差异。探讨阿司匹林疗效不佳的原因，精准评估患者对阿司匹林的反应性，明确其影响因素和调控机制，对于优化治疗策略、降低心血管事件风险、提高患者生存率和改善生活质量具有重要意义[9]。阿司匹林通过不可逆地抑制COX-1活性，干扰AA合成血栓素A222)，从而抑制血小板聚集，发挥抗血小板作用[3]。因此，AA代谢通路中的关键基因发生差异表达以及表达后修饰改变，都可能影响阿司匹林的抗血小板作用效果。AA经COX-1作用生成PGH22在血栓素合酶的作用下生成TXA222的形式存在，因此检测血浆PGH222的能力[10]。巨核细胞是血小板的前体细胞，其功能改变也可能影响血小板的生成，进而影响阿司匹林抗血小板的疗效[11]作为真核细胞中最丰富的转录后修饰之一，m6A修饰广泛参与RNA活动的多个阶段。m6A修饰的动态调控依赖于甲基化酶、去甲基化酶和阅读蛋白的协同作用[12]。甲基化酶和去甲基化酶通过调控m6A修饰水平影响RNA的稳定性和翻译效率，而阅读蛋白如YTHDF1则可识别特定m6A标记的mRNA，调控其剪接、输出、翻译和降解[13]。METTL3是甲基转移酶复合物中唯一具有催化活性的亚基，通过调控靶基因m6A修饰水平参与多种病理生理过程[14]。YTHDF1是存在最广泛的m6A修饰阅读蛋白，可与翻译起始复合物直接作用，从而提高m6A修饰基因的翻译效率[15]。METTL3表达水平的改变通过影响靶基因mRNA的m6A修饰水平使YTHDF1等结合蛋白合成量发生相应的正反馈调节，以适应靶基因mRNA翻译、降解等转录后调控的需要[16]。既往研究发现，m6A甲基化修饰参与多种心血管疾病的发生与进展，如METTL3表达参与心肌肥厚、心脏衰老、动脉粥样硬化斑块进展等过程[17]，YTHDF1表达也与血管生成及造血干细胞的生成和分化相关[18-19]。目前，尚无METTL3通过m6A修饰调控AA代谢、血小板生成及阿司匹林反应性的报道。本课题组前期研究[7]通过检测患者全血m6A甲基化水平，并采用qPCR法对m6A修饰相关的7个基因(METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2)的mRNA水平进行检测，发现阿司匹林疗效不佳的患者全血m6A甲基化水平、METTL3、YTHDF1 mRNA表达量明显升高，提示RNA m6A甲基化修饰可能参与阿司匹林反应性的调控。本研究通过体外细胞实验首次探讨了METTL3对巨核细胞系AA代谢通路的影响。通过成功构建过表达和敲低METTL3的细胞模型，研究发现过表达METTL3后YTHDF1表达量显著升高，同时促进COX-1的表达，导致AA代谢通路下游代谢产物PGH22的合成也随之增加。METTL3作为甲基转移酶复合体的重要组成部分，其水平的变化影响靶基因mRNA上m6A修饰水平，从而导致识别m6A修饰的YTHDF1等阅读蛋白合成量发生相应的正反馈改变，以适应靶基因mRNA翻译、降解等转录后调控的需要。进一步实验显示，加入mRNA翻译抑制剂CHX后，过表达METTL3未见COX-1的蛋白水平表达升高，这一结果表明METTL3的改变可能影响了COX-1 mRNA的翻译。本研究还通过RIP实验验证了YTHDF1可与COX-1 mRNA结合。过表达METTL3在提高YTHDF1水平的同时，可能通过增加了COX-1 mRNA的m6A修饰水平，更多被m6A修饰的COX-1 mRNA与阅读蛋白YTHDF1结合，从而促进COX-1 mRNA的翻译，最终导致了COX-1蛋白水平的升高和下游代谢产物的增多。此外，本研究还探讨了巨核细胞功能对血小板生成及阿司匹林反应性的影响。血小板作为由巨核细胞产生且不具备自主增殖能力的细胞碎片，其生成能力受到巨核细胞增殖和凋亡的显著影响[11]。Wu等[20]研究显示，METTL3对体内正常造血细胞的发育和分化具有重要作用。Cattaneo等[21]研究表明，血小板增多症是导致阿司匹林疗效不佳的原因之一，需要增加阿司匹林使用剂量。本课题组的另一项研究显示，过表达METTL3可以促进巨核细胞增殖，敲低METTL3可以抑制巨核细胞增殖和促进巨核细胞凋亡，推测METTL3可能通过影响RNA m6A修饰水平改变巨核细胞的生长及分化状态，从而间接影响血小板生成和阿司匹林疗效。综上所述，本研究首次揭示了METTL3通过m6A甲基化修饰调控巨核细胞系AA代谢通路的潜在机制(图9)，为深入理解AA代谢相关基因的转录后调控提供了新视角。然而本研究也存在一些局限性，如仅限于体外细胞实验探讨AA代谢通路；METTL3水平变化导致YTHDF1水平正反馈调节的具体分子机制尚不明确；阿司匹林抗血小板疗效受多种因素共同调控，单一机制的研究难以全面揭示其复杂的调控网络。随着基因组学和表观遗传学检测技术的快速发展，未来研究可从多角度进一步探索METTL3以及RNA m6A修饰在阿司匹林反应性中的具体作用机制，为实现阿司匹林个体化和精准化治疗、降低心血管事件风险提供新的思路和方向。
图9 METTL3对巨核细胞影响的潜在机制
来源：中国心血管杂志