硫黄素T测定α-突触核蛋白的实验方案

摘要：α-突触核蛋白（α-Synuclein）是一种主要存在于中枢神经系统突触前终末的小分子蛋白质，由140个氨基酸组成，分子量约为19 kDa。它在生理状态下主要以可溶性单体形式存在，但在病理条件下，α-突触核蛋白会发生错误折叠并聚集，形成β-折叠结构的寡聚体和纤

α-突触核蛋白（α-Synuclein）是一种主要存在于中枢神经系统突触前终末的小分子蛋白质，由140个氨基酸组成，分子量约为19 kDa。它在生理状态下主要以可溶性单体形式存在，但在病理条件下，α-突触核蛋白会发生错误折叠并聚集，形成β-折叠结构的寡聚体和纤维，最终导致路易小体（Lewy bodies）的形成，与帕金森病等神经退行性疾病密切相关。

α-突触核蛋白聚集过程可能通过细胞间传播，诱导邻近细胞内的蛋白聚集，加剧神经元损伤。研究其聚集机制和检测方法对于理解疾病发生发展及开发诊断手段具有重要意义。

目前，检测α-突触核蛋白的方法多样，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、种子扩增测定（SAA）、荧光染料法（如硫黄素T）、单分子荧光成像技术以及圆二色谱（CD）等。这些方法可分别用于检测体液中α-突触核蛋白水平、监测其聚集过程及研究其在细胞中的动态行为，为疾病诊断和药物研发提供了有力支持。

本文主要介绍利用硫黄素T（Thioflavin T，ThT）荧光染料法测定α-突触核蛋白的实验方案。ThT是一种荧光染料，能够特异性结合β-折叠结构的α-突触核蛋白聚合物，结合后荧光强度显著增强。常用于体外监测α-突触核蛋白的聚集过程，适用于研究聚集动力学。

实验步骤

1.使用dH2O制备1 mM硫黄素T储备溶液，新鲜制备并通过0.2 μm 注射器过滤器过滤。

2.用PBS（pH 7.4）稀释硫黄素T储备溶液，确保每个孔中的硫黄素T最终浓度为25 μM（每孔溶液体积= 100 μL）。

3.提前将α-突触核蛋白试样解冻至室温。

4.在对应的孔中添加10 µM聚集体或100 μM单体（或二者混合物）。用移液器将孔中液体上下吸入吹打混合。

注意：这里的浓度为估计值，针对不同的实验或者样本，需要进一步优化来得到好的信号。

5.密封孔板，并放入振荡培养箱中。600 rpm，37°C孵育。

6.使用荧光酶标仪检测荧光信号，设置激发波长为450 nm，发射波长为485 nm。在孵育过程中定时读取荧光强度。

在37°C下读取，读取时间为1小时至72小时。