福州大学杨黄浩/张进、中科院长春应化所丁建勋、上海交大许婧AFM：具有级联微环境响应性的自适应水凝胶用于抑制骨肉瘤并促进骨重建

摘要：骨肉瘤（OS）是一种高度恶性的骨肿瘤，主要影响儿童和青少年，全球每年约有26,000例新发病例，死亡率较高。该肿瘤具有较高的复发和转移倾向，导致5 年总体生存率低于20%，这使得OS在临床治疗中极具挑战性。目前，OS的主要治疗方法是新辅助化疗联合肿瘤特异性手术

骨肉瘤（OS）是一种高度恶性的骨肿瘤，主要影响儿童和青少年，全球每年约有26,000例新发病例，死亡率较高。该肿瘤具有较高的复发和转移倾向，导致5 年总体生存率低于20%，这使得OS在临床治疗中极具挑战性。目前，OS的主要治疗方法是新辅助化疗联合肿瘤特异性手术切除，这使得局部骨肿瘤患者的5 年生存率提高到了近60%。然而，目前手术切除后应用的植入物仅能提供结构支撑，缺乏调节炎症反应、抑制肿瘤转移或复发以及有效促进临界骨缺损修复的能力。

鉴于此，福州大学杨黄浩/张进教授联合中国科学院长春应用化学研究所丁建勋研究员、上海交通大学许婧教授，通过将自组装的1-溴乙酰基-3,3-二硝基氮杂环丁烷（RRx-001）/吲哚菁绿（ICG）@含二硒化物纳米粒子（R/I@SeNP）整合到聚丙烯酰胺/海藻酸钠/透明质酸（PAAm/SA/HA）水凝胶基质中（示意图1 ），成功制备了一种名为RPSH的自适应多功能复合水凝胶。在RPSH水凝胶植入肿瘤型骨缺损部位后，高分子量HA在24 h内有效抑制NF-κB信号通路，诱导巨噬细胞从促炎性M1表型向抗炎性M2表型极化，从而初步逆转OS切除后的炎症微环境。随后，双响应R/I@SeNP通过上调ROS/RNS水平和生成硒醇（RSeH）和硒酸（RSeO(OH)）来实现光热（PTT）、光动力（PDT）联合免疫疗法的多模式抗癌策略，术后3周肿瘤生长抑制率为72.84% ± 6.75%。值得注意的是，RPSH水凝胶通过有效维持成骨−破骨活性平衡并减少骨吸收，来促进大量新骨的形成，骨体积/总体组织体积（BV/TV）在植入8周后达到了59.03% ± 9.41%，表明其具有持续创造有利于骨再生的微环境的能力。总之，这种自适应水凝胶通过减轻炎症反应、彻底清除残留肿瘤细胞以及促进骨组织再生，高效调控术后三阶段微环境，展现出作为OS预后候选方案的良好应用前景。

该研究以“Self-Adaptive Hydrogel with Cascade Microenvironments-Responsiveness to Inhibit Osteosarcoma Progression and Augment Bone Reconstruction”为题发表在《Advanced Functional Materials》上。论文共同第一作者为福州大学硕士研究生生林海榕、上海交通大学博士研究生生金新蒙以及福州大学硕士研究生曹洋。通讯作者为福州大学杨黄浩教授与张进教授、中国科学院长春应用化学研究所丁建勋研究员、上海交通大学许婧教授。

该工作得到科技部国家重点研发计划青年科学家项目、国家自然科学基金区域联合重点项目、中国科协青年人才托举工程项目、福建省雏鹰计划青年拔尖人才、福建省杰出青年基金、新基石研究员项目等的资助。

示意图1. 用于术后OS治疗的自适应水凝胶的合成路线及多功能性

R/I@SeNP纳米粒子的制备及表征

研究人员合成了一种具有氧化还原双重响应性的嵌段两亲共聚物，其包含一个疏水性含二硒化物嵌段和两个亲水性聚乙二醇（mPEG）嵌段，并在水相中表现出自组装特性。含二硒化物嵌段的合成是通过在四氢呋喃（THF）溶液中使2,2'-二硒代二乙醇与稍过量的1,3-亚苯基二异氰酸酯（mPDI）发生聚合反应实现的。随后，将末端含活性mPDI基团的聚氨酯嵌段用mPEG6000进行封端，最终制得ABA型含二硒化物两亲嵌段共聚物。通过将ICG、RRx-001与mPEG6000-(mPDI-co-2,2'-二硒代二乙醇)-mPEG6000混合溶液进行超声处理，成功实现了R/I@SeNP的自组装。研究人员验证了SeNP的成功制备，更表明R/I@SeNP能有效保持包载药物的功能完整性。

图1. SeNP及R/I@SeNP的合成与表征

22和GSH的双重响应机制，该特性可在氧化/还原刺激下诱导纳米颗粒解体，有利于实现肿瘤部位靶向释药。并初步评估了R/I@SeNP在体外PTT和PDT的潜力。这种精准可控的光热性能为后续抗肿瘤效率研究奠定了基础。

图2. SeNP和R/I@SeNP的双重响应性、光热及光动力特性

RPSH水凝胶物理性能及药物释放行为

研究人员对复合水凝胶的物理特性进行了研究。RPSH水凝胶内部同时包含PAAm与SA分子链间的共价交联网络，以及在Ca²⁺促进下形成的SA链的离子交联网络。RPSH水凝胶合适的孔径分布在0.75−1.05 μm范围内，有利于细胞生长及代谢物与信号分子的运输。水凝胶的力学性能通过拉伸与压缩测试进行评估，结果表明其具有适合体内植入的力学强度，可促进间充质干细胞（MSC）向成骨细胞分化及新骨形成。水凝胶的降解行为对于组织再生和药物释放速率控制至关重要。RPSH水凝胶在模拟体内肿瘤TME下，28 天后残余质量百分比为25.16% ± 2.05%，与骨修复周期高度契合。得益于R/I@SeNP中Se−Se键的双重响应特性以及水凝胶自身的降解特性，在模拟氧化−还原环境下，72 h内RRx-001和ICG的释放率分别达78.90% ± 0.04%和88.55% ± 1.74%。因此，RPSH水凝胶能对TME中的高浓度GSH与H₂O₂作出响应，实现智能、靶向药物释放。水凝胶在OS切除术后牢固黏附于缺损部位对于持续调控肿瘤样骨缺损微环境、提高治疗效果至关重要。研究人员通过剪切粘附测试定量评估了不同水凝胶与湿润猪皮之间的粘附强度，保证了水凝胶在植入部位的固定，降低了移位或脱落风险。

图3. RPSH水凝胶的物理性能与药物释放行为

RPSH水凝胶体外生物相容性与抗炎效果

肿瘤切除后的炎症反应对肿瘤细胞增殖、复发及骨再生具有深远影响。为探究不同水凝胶的抗炎效果，研究人员将RAW264.7巨噬细胞与PS、PSH、RPS及RPSH水凝胶共培养，以评估各水凝胶调节巨噬细胞表型的能力。如图4A所示，对照组巨噬细胞最初呈不规则圆形，在LPS刺激后极化为梭形的M1表型，而PSH及RPSH组巨噬细胞恢复为圆形状态，这可能归因于水凝胶中高分子量HA与细胞表面CD受体结合抑制了NF-κB活化，从而发挥了抗炎作用。进一步地，研究人员分析了不同水凝胶处理后巨噬细胞分泌的促炎性和抗炎性细胞因子的水平。如图4B，C所示，PSH或RPSH水凝胶共培养的巨噬细胞的TNF-α分泌水平明显低于其他组，而IL-4的分泌水平显著高于对照组，表明RPSH水凝胶有效缓解OS切除术后的炎症反应，维持有利于骨组织修复的抗炎微环境。

图4D展示了与RPSH水凝胶共培养后巨噬细胞表型转变的三阶段示意图。第一阶段：RPSH水凝胶通过抑制NF-κB信号通路有效诱导巨噬细胞向M2表型极化，导致促炎性细胞因子（TNF-α）表达降低，抗炎性细胞因子（IL-4）表达升高，有助于术后早期炎症的迅速缓解。第二阶段：在PTT和PDT联合下，RPSH水凝胶初步清除肿瘤细胞。随后，肿瘤细胞碎片及细胞内组分（如抗原和损伤相关分子）刺激巨噬细胞重新极化为M1型，同时招募更多M1型巨噬细胞至病灶区域。这一行为增强了免疫激活，建立了后续抗癌阶段所需的促炎性微环境。第三阶段：HA持续释放长期调节巨噬细胞极化。高分子量HA通过与CD受体结合并抑制NF-κB活化，促进巨噬细胞向促修复的M2表型极化，进一步通过改善血管生成水平支持成骨。总之，RPSH水凝胶能够在OS治疗的不同阶段维持巨噬细胞表型的精确平衡。

图4. RPSH水凝胶的抗炎效果

RPSH水凝胶体外肿瘤治疗效果与抗癌机制

在有效调控早期术后炎症微环境后，应联合应用多种辅助治疗手段以协同消除残留肿瘤细胞并提升预后效果。研究人员通过流式细胞术定量评估了各组肿瘤细胞的凋亡比例，进一步验证了复合水凝胶对肿瘤细胞的杀伤作用（图5A，B）。随后，采用qRT-PCR和ELISA分别检测了不同组别中血管生成相关基因和蛋白的表达水平（图5C，D）。在含有R/I@SeNP的组别中，MMP-9和VEGF-A的表达水平显著降低，表明复合水凝胶在抗癌期间具有良好的抗血管生成作用。研究人员将DCFH-DA荧光探针来探究PDT诱导的细胞毒性机制（图5E），提示治疗过程中有效生成了ROS。抗癌效果与细胞内ROS生成的一致性表明，NIR照射诱导的细胞毒性是治疗效果的根本驱动力。为进一步揭示RPSH水凝胶在NIR照射下诱导协同肿瘤治疗的机制，研究人员开展了K7M2细胞的RNA测序（RNA-seq）分析（图5F−M）。具体而言，内质网脂筏相关蛋白1 （ERLIN1）表达下调，抑制了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。同时，C-X-C基序趋化因子配体10 （CXCL10）、连接蛋白α1（GJA1）和C-C基序趋化因子配体7 （CCL7）等基因的上调，表明联合治疗促进了细胞间通信，并促进了免疫细胞的浸润与活化，从而提高了肿瘤免疫治疗的效果。

图5. RPSH水凝胶的体外肿瘤治疗效果及抗癌机制

RPSH水凝胶体外成骨活性及促成骨机制

成骨细胞分化是影响骨再生效率的关键因素，研究人员采用碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红S（ARS）染色、蛋白印迹（WB）和qRT-PCR方法评估了不同处理后MSCs的成骨分化情况（图6A−G）。其中，ALP、Col I与Runx2的上调标志着成骨分化早期骨基质的成熟，而OPN的上调则表明了成骨后期矿化过程的增强。为进一步探究组合治疗的成骨机制，从经RPSH+NIR处理或PBS处理的MSCs中提取总RNA，并进行转录组测序及后续分析（图6H−K）。治疗组显著富集了TGF-β与MAPK通路，有助于骨代谢并促进成骨分化。RPSH+NIR组还促进了骨修复过程中的血管重塑，通过促进营养物质和细胞因子的运输，加速了骨缺损的愈合。综上，RPSH水凝胶通过促进成骨因子的分泌及调控成骨−骨吸收平衡，建立了有利的微环境，从而有效增强了成骨分化及后续骨再生过程。

图6. RPSH水凝胶的体外成骨活性及促骨生成机制

体内肿瘤治疗效果

为了验证体内肿瘤治疗效果，研究人员将肿瘤裸鼠分为七组，通过植入不同水凝胶并结合NIR照射，发现RPSH+NIR组展现出最良好的抗肿瘤效果：肿瘤生长抑制率达72.84%，肿瘤体积最小（371 ± 112 mm³），肿瘤重量最轻（0.54 ± 0.13 g）。同时，小鼠体重稳定，60 天时的生存率约为50%。组织学分析进一步证实，联合治疗组肿瘤组织中M1型巨噬细胞浸润增加、M2型巨噬细胞比例下降的现象。以上所有结果表明，协同PTT、PDT和免疫治疗是有效的肿瘤消融策略。

图7. RPSH水凝胶的体内肿瘤治疗效果

大鼠颅骨临界骨缺损模型中的成骨性能评估

为进一步验证RPSH水凝胶在体内的成骨效果，研究人员在大鼠体内建立了5 mm临界颅骨缺损模型。Micro-CT扫描和组织染色结果显示，含HA成分的水凝胶组在术后8周实现了显著的骨再生，新形成的连续骨组织良好桥接并几乎完全覆盖了缺损区域。定量分析表明，含HA治疗组在第8 周时的BV/TV比例最高，为59.03% ± 9.41%，BMD值最高，为889.82 ± 34.48 mg cm⁻³，表明成熟骨组织的形成量显著提高。RPSH水凝胶不仅通过HA的有效成分调节成骨−溶骨平衡，还在长期内促进了MSC的增殖与分化，调控了有利于骨再生的微环境，加速了骨缺损的愈合。