摘要：冷冻电镜样品制备质量对最终实验结果至关重要。本文详细介绍了从载网选择到数据采集的完整工作流程，强调载网的质量评估、正确处理和存储对防止污染和损坏的重要性。阐述了表面处理技术（如等离子体处理）对优化蛋白质样品在玻璃态冰中分布的影响，以及全金载网、石墨烯等材料如何
半导体工程师 2025年05月21日 09:11 北京
冷冻电镜样品制备质量对最终实验结果至关重要。本文详细介绍了从载网选择到数据采集的完整工作流程，强调载网的质量评估、正确处理和存储对防止污染和损坏的重要性。阐述了表面处理技术（如等离子体处理）对优化蛋白质样品在玻璃态冰中分布的影响，以及全金载网、石墨烯等材料如何显著提高样品稳定性和减少电子束辐射下的样品移动。精确控制的样品玻璃化过程和优化的成像参数是获取高分辨率结构数据的基础。
L.A. Passmore, C.J. Russo, Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM, Methods in Enzymology,2016
1. 载网的选择、处理与储存
载网质量评估与选择
在冷冻电镜样品制备过程中，载网的质量直接影响最终的实验结果与数据可靠性。这些微米级的精密载网极易受到物理损伤或环境污染，因此必须谨慎处理。在实验开始前，应使用光镜对载网进行全面检查，及时淘汰存在明显缺陷、大面积破损或污染的载网。
尽管这一预检步骤看似繁琐，但与后续样品制备和成像过程所耗费的时间相比，这一投入微不足道，却能显著提高实验的成功率和数据质量。
就载网类型而言，市场上既有不规则排列（如蕾丝状或多孔碳）的载网，也有具有规则孔洞阵列的产品（如Quantifoil、UltrAuFoil、C-flat等）。后者因其结构的高度规整性，不仅提供了更好的实验重复性，还能简化数据采集方案，因此在高精度研究中更受青睐。
在材料选择方面，针对不同的应用场景，我们（L.A. Passmore, C.J. Russo）有如下建议：负染色技术可选用铜基底上的无定形碳（am-C）载网，这类产品普遍易得且价格适中；而冷冻电镜应用则推荐使用全金载网，因其能有效减少样品在电子束照射下的移动，显著提高成像质量。全金载网可以按照Russo和Passmore（2016）描述的方案自行制备，或直接从Quantifoil等供应商处购买商业化产品（如UltrAuFoil®）。
载网的正确处理方案
载网的处理技术看似简单，实则需要精细操作。首要原则是始终保持载网平整，避免任何可能导致薄膜损坏的弯折。在操作过程中，应当使用锋利的精密镊子，仅从载网的边缘进行夹持和移动（图3）。我们特别推荐使用常闭构型的镊子（如Dumont N5型），这类镊子能在处理过程中对载网施加明确且可控的力度，减少人为操作差异导致的载网损伤。
图3 镊子对样品载网的损坏。弯曲的镊子（A）或不当使用（B）会导致样品载网损坏。为获得最佳效果，应使用尖锐、笔直的镊子（C），并且仅从边缘处夹取载网（D）。对于A和C面板，比例尺为1毫米。对于B和D面板，比例尺为100微米。
在处理过程中，静电放电是另一个常被忽视却能造成严重损害的因素。佩戴腕部接地带是一种简单有效的防静电措施（图4）。值得注意的是，我们不建议在操作镊子的手上佩戴手套，尽管这在某些实验环境中是标准做法，但在载网处理中，手套不仅会导致镊子和载网上积累静电，还会降低操作的灵敏度和精确性。
图4 存放载网以避免污染和静电。A面板展示了载网处理中的不良做法：使用手套和塑料存储盒会导致静电积累。图中，带电的载网正立在边缘上。B面板展示了推荐的处理程序，包括使用玻璃容器，拿镊子的手不戴手套，以及佩戴腕部接地带以防止静电积累。
载网的储存环境与条件
经过清洁或修饰的载网应当妥善储存，以维持其表面性质和结构完整性。最佳的储存容器是玻璃培养皿，而非塑料制品，因为后者可能释放有机残留物，污染载网表面。储存环境应为干净、无油脂的干燥盒，确保环境中无尘埃颗粒。这种严格的储存条件对于维持载网的高质量状态和实验的可重复性至关重要。
为防止样品交叉污染并消除环境污染物，所有用于载网处理的工具、玻璃载片和容器都应定期进行彻底清洁。玻璃制品可通过在高纯度洗涤剂溶液（如2%的Micro-90）中进行超声波处理，随后用超纯18 MΩ去离子水充分冲洗的方式进行清洁。镊子在日常使用后，可采用酒精（乙醇或异丙醇）超声波清洗；如发现有塑料或油脂残留物的污染，则需使用更强效的溶剂，如氯仿和丙酮进行处理。
特别需要强调的是，用于载网冷冻的镊子应在每次处理不同样品后进行彻底的乙醇超声波清洗，以消除潜在的污染。实践表明，通过镊子从一个载网到另一个载网的交叉污染是非常普遍的现象，这种微量污染虽难以察觉，却可能对实验结果产生显著影响。在高精度结构分析中，这种看似微小的细节往往是确保数据可靠性的关键因素。
2.载网的污染控制与清洁技术
即使在最优化的储存条件下，载网在使用前仍可能需要额外的清洁处理。污染来源多种多样，主要包括以下几类：
颗粒物质污染：包括蒸发的碳片、制造过程中的残留颗粒或储存过程中积累的环境灰尘。这些颗粒物质如不及时清除，会在加入水性蛋白质溶液时重新悬浮，并最终在玻璃态冰中形成可见的杂质，干扰后续的数据处理与分析。
有机残留物污染：主要来源于处理或储存过程中沉积在表面的有机物质，以及制造过程中使用的光刻胶或其他高分子材料及溶剂残留。这类污染物会显著影响载网的润湿性和其他物理化学特性，降低实验的可重复性和结果的一致性。
以下提供一种通过水和溶剂系统清洗来净化载网的方案。需要特别注意的是，清洁过程中应使用超高纯度（CMOS级）溶剂，以避免引入新的污染物。我们不推荐采用加热法清洁载网，因为高温可能破坏载网的结构完整性，导致薄膜变形或断裂。
安全警告：本方案涉及使用高电压、高温、液态氮、易燃化学品/气体，以及在真空条件下操作的设备。这些操作应由经验丰富的科学人员执行，且操作者应已完成所有相关的安全培训并进行了风险评估。请务必佩戴安全眼镜和适当的防护装备，并自行承担操作风险。
方案1.（载网清洁程序）
1.用高纯度去离子水（18 MΩ，经过滤与UV处理）填充干净的玻璃结晶皿（推荐使用Pyrex材质，直径90毫米，高50毫米）。水应添加至略微溢出容器边缘，以打破表面的弯液面，有效去除水表面上可能存在的任何污染层（图5C）。
图5 去除样品载网上的表面污染。载网可以依次用（A）氯仿、丙酮和异丙醇清洗。必须注意避免水（或溶剂）表面的污染物沉积到载网上。B面板展示了一个示意图。如C面板所示，容器装得过满可以减少表面污染。比例尺为20毫米。
2. 准备三种溶剂洗涤液，分别置于干净的小玻璃试管中（图5A）：
试管一：1毫升氯仿（建议使用Sigma 650498或同等纯度产品）
试管二：1毫升丙酮（Sigma 40289或同等品）
试管三：1毫升异丙醇（Sigma 40301或同等品）
溶剂操作应使用玻璃巴斯德吸管，因为多数有机溶剂会溶解塑料制品，可能导致塑料残留物重新沉积于载网表面。
3. 使用干净的精密镊子（Dumont N5或5型）小心夹取单个载网，将其缓慢浸入晶体皿一侧的水中。此时，载网表面的松散污染物可能会漂浮至水面。为避免这些漂浮污染物重新沉积到载网上，应将载网横向穿过水，从晶体皿的另一侧取出。在穿水过程中，确保载网的薄边缘朝前，以减少对穿孔薄膜的损伤风险。取出后，将载网边缘轻轻接触滤纸（Whatman No. 1型）以去除多余水分，但务必注意不要使载网发生弯折。如使用非防毛细管镊子，应在镊子尖之间进行吸干操作。
4.依次将载网浸入前述准备的三种溶剂中，每种溶剂浸泡10-20秒。最后一步的异丙醇漂洗尤为关键，应使用最纯净的溶剂，因为此阶段的任何残留物都将直接沉积在载网表面。如使用非防毛细管镊子，每次漂洗后应在镊子尖之间吸干多余溶剂。
5.将载网边缘轻触滤纸，去除残留的异丙醇。
6.将载网放置在干净玻璃培养皿（建议使用Schott，70毫米型号）中的滤纸（Whatman No. 1，70毫米圆形）上，薄膜面朝上，自然晾干。培养皿应盖上玻璃盖，减少环境灰尘的沉积。
7.完全干燥后，载网应存放在有盖的玻璃培养皿中，但最佳实践是在清洁后尽快使用，以确保表面特性的稳定性。
3. 非晶碳和石墨烯连续薄膜的制备与应用
非晶碳或石墨烯的连续薄膜为蛋白质样品提供了一种与基底相互作用的替代表面。在特定情况下，这类薄膜可以显著改善蛋白质在玻璃态冰中的分布状态或分子取向。此外，由于颗粒可以在吸走多余液体前吸附到薄膜表面，因此有时可以使用较低浓度的蛋白质溶液，这不仅节约了宝贵的样品，还能优化成像条件。
以下提供一种制备薄层（2-5nm）非晶碳薄膜的详细方案，该薄膜可作为颗粒吸附的理想表面。同样的方案也适用于制备较厚（5-10 nm）的碳薄膜，可转移至无穿孔薄膜的裸载网上用于负染色技术。
方案2.（非晶碳沉积程序）
本方案基于使用配备水冷式Inficon晶体厚度监测器的Edwards 306 Turbo镀膜系统将碳沉积到云母片上的流程，但可根据实验室现有设备进行适当调整。
1 打开系统通风口，移除防爆罩和玻璃钟罩。
2 操作前戴上无粉末污染的干净手套，并在处理腔内所有组件时保持手套佩戴状态。
3 取下碳源装置，移除屏蔽罩，在夹头中安装一根新的尖锐碳棒（应选用高纯度石墨，杂质含量
4 使用压缩氮气彻底吹除任何碳屑或碎片，这些微小颗粒可能导致电极间短路，影响沉积质量。
5 将碳源装置重新放置于真空腔内，调整碳棒位置使其距离样品台约125毫米。固定时仅需用手指拧紧螺母，无需使用扳手，以避免过度应力。
6 云母作为一种多层矿物晶体，具有极其平整的表面特性（每平方毫米均方根粗糙度小于1纳米），且易于获取大面积样品，因此被广泛用作碳沉积的模板基底。取一片云母（如Agar G250-1型号），用刀片将其一分为二，将两片云母片放置于样品台上，劈裂面朝上，直接位于碳源正下方，并放在新的滤纸（Whatman No. 1）上。云母应在涂覆前立即新鲜劈开，因为新劈开的表面具有理想的清洁度和亲水性，而在空气中长时间暴露后会被环境污染物覆盖，导致表面疏水化。
7 可使用一枚干净的金属硬币或类似小金属片在真空抽气过程中固定云母片和滤纸，防止移位。
8 检查挡板在开启和关闭状态下的位置：关闭时应完全覆盖从碳源到云母和晶体厚度监测器的立体角；开启状态下，通向云母和晶体的路径应无障碍且路径长度相等。初始状态应保持在关闭位置。
9 仔细检查钟罩垫圈和底板是否存在灰尘、污垢或碳、金属碎片。如有必要，使用无绒纸和高纯甲醇进行彻底清洁。
10 重新安装玻璃钟罩和防爆罩。
11 填充液氮冷阱至适当液位。
12 按下控制面板上的循环按钮启动真空抽气过程。
13 当门阀打开时，系统压力应迅速降至10^-5托范围。此时可以通过打开低压电源（LT）并缓慢增加电流至约1.0安培，开始预热碳源装置。
14 等待10分钟后，将电流缓慢增加到1.2安培。
15 再等待5分钟，将电流增加到1.4安培。
16 在1.4安培维持20分钟，随后关闭电源。此时应补充液氮至冷阱。
17打开晶体厚度监测器的冷却水系统，并确认已选择正确的碳程序参数。将厚度显示归零。
18 系统真空度应在约一小时内降至10^-7托范围，这是进行高质量碳沉积的必要条件。
19 一旦真空度达到5×10^-6托。
20 当碳开始沉积时，电流指示将出现轻微波动。此时打开挡板进行10-20秒的沉积，随后关闭挡板并略微降低电流。
21 晶体监测器在初始阶段可能会由于热效应显示负值，但在关闭挡板后，显示值将恢复至一个正数，这代表了累积的碳膜厚度。可重复上述过程直至达到所需厚度。
22 完成沉积操作后，关闭挡板并完全关闭碳源电源。
23 在通风打开系统前，应让真空腔冷却至少30分钟，以确保沉积碳膜的稳定性。
24 使用干燥氮气缓慢通风，取出涂覆的云母片并存放在洁净的玻璃培养皿中。
25 重新安装钟罩和防爆罩，按下循环按钮启动抽真空，待真空度达到200毫托后，按下密封按钮完成系统密封。
重要注意事项
晶体厚度监测器应按照制造商的说明，使用独立的厚度测量方案定期校准。在我们过去的研究中，曾使用原子力显微镜进行此类校准（Russo & Passmore, 2014a）。碳密度可能因源材料质量而略有差异，但通常应约为2.2 g/cm³。从启动到完成，整个沉积过程不应超过4小时。除非使用完全干燥（无油）的抽气系统，否则不建议过夜抽气，因为当液氮阱温度回升时，泵油可能回流至腔体，造成系统和云母样品的油污染。我们在之前的研究中提供了一个将非晶碳转移到各类载网上的详细方案（Russo & Passmore, 2016），该方案在Quantifoil和全金载网上均表现出色。这一转移方案在方案3中有详细描述，可作为制备高质量碳薄膜载网的重要补充工艺。
方案3：无定形碳向载网的转移
实验操作过程中，静电放电可能对载网造成不可逆损伤，因此必须采取适当防护措施。同时，载网的质量控制也是实验成功的基础。具体操作步骤如下：
1佩戴腕部接地带，防止在操作过程中产生静电而损坏载网。使用镊子时，操作者不应佩戴手套，或确保镊子直接接地，以消除静电积累的可能性。
2 在电镜下仔细检查载网，剔除任何存在缺陷的部分。合格的载网应当表面平整、结构连续，且无灰尘或纤维状杂质附着。
3 若发现载网表面存在光刻处理残留的塑料物质，可依照方案1进行彻底清洁处理。
4 为防止指纹和外源污染，佩戴手套将滤纸（Whatman No. 1，直径70毫米）置于不锈钢网圆片（直径65毫米，由0.7毫米线制成，载网为3毫米）上。该网片应放置在玻璃结晶皿（Pyrex材质，直径90毫米，高度50毫米）中的不锈钢环（经抛光和倒角处理的边缘，厚度2毫米，高度10毫米，直径50毫米）内（参见图6）(Russo & Passmore, 2016)。
图6 在载网上沉积无定形碳薄膜的装置。A面板显示了浮动室的横截面图。随着水位的降低，无定形碳的薄膜被沉积到载网上。不锈钢环形成一个正弯月面，帮助将碳膜向环的中心降低。B面板显示了该装置使用中的照片。doi: 10.1016/j.jsb.2015.11.006。
5 用高纯度去离子水（18 MΩ，经过滤和UV处理）填充结晶皿。注水至溢出状态以破坏表面张力形成的弯月面，并去除水表面的任何潜在污染层（参见图5C）。随后倾倒多余水分，使水位恰好低于玻璃皿边缘。
6 使用经溶剂冲洗清洁的镊子（Dumont N5或5型号），谨慎地将载网放置在滤纸中央，箔面朝上。载网应垂直于水面缓慢浸入，以避免气泡形成和载网损坏。
7 设置虹吸系统：将管道（长0.6米，外径3.2毫米，内径1.6毫米）连接至配有常闭镊子或弹簧夹的收集容器。通过注射器启动虹吸流动，并在碳膜漂浮过程中（下一步骤）暂时夹住管道控制流速。
8 通过以20-30°角缓慢将一片约2.5×2.5厘米的无定形碳涂覆云母片（碳面朝上）浸入水中，使碳膜从云母基底漂浮分离。可采用掠角光源照射水面，增强对漂浮碳膜的可视化观察效果。
9 借助虹吸系统逐渐降低水位，控制碳膜的下降速度。
10 密切监控碳膜相对于载网的位置，必要时用清洁的镊子轻推调整，确保碳膜始终保持在载网中央位置。
11 当碳膜完全沉积于载网表面且水位降至低于滤纸时，小心取出不锈钢环。随后取出滤纸与网片整体，置于干燥滤纸上，并用洁净的玻璃培养皿或烧杯覆盖，覆盖物应略微倾斜以留出水分蒸发空间。令其在室温下自然干燥数小时。
12完全干燥后，将制备好的样品置于洁净的玻璃培养皿中保存，直至使用前。
石墨烯作为新型二维材料，因其确定的晶格结构和卓越的导电性能，在多方面优于传统的无定形碳。尤为重要的是，在冷冻电镜关注的分辨率范围内，石墨烯实际上几乎不可见，而无定形碳则会引入额外的背景噪声，这对于研究较小蛋白质结构特别不利。以下内容详细介绍将石墨烯转移到Quantifoil载网上的精确程序（参见图7，方案4）(Regan et al., 2010)。
此转移过程需使用超高纯度（CMOS级）溶剂和酸性试剂以确保转移的可靠性并避免污染。整个操作过程中，操作者应始终佩戴腕部接地带，防止静电放电损害载网，因石墨烯薄膜对静电特别敏感。所有玻璃器皿在使用前必须经过彻底清洁。值得注意的是，全金属载网的新型转移方案正在研发中，未来石墨烯全金载网有望实现商业化供应。
方案4：石墨烯向载网的转移
1 仔细检查新清洁的载网（Quantifoil Au 300 1.2/1.3，参照方案1的清洁方案），剔除任何存在缺陷的载网。
2 石墨烯通常通过化学气相沉积(CVD)方案生长在薄铜基底上，可从专业商业供应商（如Graphene Supermarket，Structure Probe Inc.等）购买。从已确认存在石墨烯的铜/石墨烯源材料上冲压出3.2毫米的圆盘（图7B，C）。本实验室采用定制的机械冲头，此类工具亦可从Structure Probe, Inc.获取。
图7 石墨烯转移到带有碳膜的支撑物上。该过程在A面板中以图表形式展示。B和C面板显示在空气中加热至150°C持续10分钟的铜，其中B完全覆盖着石墨烯因此不会氧化，而C没有石墨烯覆盖因此由于氧化而变色，比例尺为3毫米。这种简单的测试用于标识箔片上石墨烯的位置。D和E面板显示载网-石墨烯-铜三明治结构，比例尺分别为1毫米和10微米。F面板展示了在蚀刻剂中漂浮的三明治结构，其中可以看到部分被蚀刻的铜晶粒（比例尺1毫米）。G面板是带有冰的悬浮石墨烯的电子衍射图案，箭头指向来自石墨烯晶格的2.1埃反射。
3 将经检查的载网置于每个圆盘上，箔面朝下。
4 将组装好的结构夹在两片洁净玻璃片之间加压，随后移除顶部玻璃片。
5 使用洁净移液管，在载网-石墨烯-铜三明治结构顶部精确加入7微升异丙醇（Sigma 40301）并待其自然干燥。
6 在高分辨率光镜下仔细检查，确认碳箔是否与铜表面充分附着。成功附着的区域会呈现明显的颜色变化（图7E），只有附着良好的区域才能在后续步骤中成功转移。
7 在通风橱内有序摆放并标记七个硼硅酸盐玻璃结晶皿（直径70毫米）。
8 在第一个结晶皿中注入约2/3容量的含缓冲FeCl3的铜蚀刻剂（Sigma 667528）。
从玻璃片轻轻滑动，将载网圆盘三明治结构小心放置在FeCl3液面上。使用硼硅酸盐玻璃培养皿盖（直径80毫米）覆盖，防止蚀刻过程中灰尘侵入。
9 在FeCl3溶液中进行蚀刻约20分钟（适用于25微米厚的铜基底）。
10 分别在三个结晶皿中注入约2/3容量的20% HCl（Sigma 40233）、20% HCl和2% HCl溶液。
11 利用经火焰处理的铂环（自制或EMS 70944）将载网逐一转移至各溶液皿中。每个步骤中让样品漂浮10分钟，完成充分清洗。
12用最高纯度的去离子水填充另外三个结晶皿，作为最终清洗步骤。
13 继续使用铂环转移技术，在每个水浴中冲洗样品3-5分钟。
14 最后一次使用铂环转移并翻转样品，使石墨烯面朝上，放置在滤纸上（Whatman No. 1，70毫米圆片）。将其置于洁净的硼硅酸盐玻璃培养皿（70毫米）中自然干燥。
15 将实验产生的酸性废液按照实验室规定的危险废物处理流程适当处置。
16 长期保存时，应将样品置于无任何油类或碳氢化合物的干燥环境的玻璃容器中。切勿使用任何类型的塑料容器存储，以避免潜在污染。
4 载网表面处理技术
载网表面通常呈疏水性，这会阻碍水溶液在其表面的有效铺展，影响样品制备质量。为精确控制表面亲水性，可采用低能等离子体处理技术（图8）。此过程中，从低压气体产生的离子和自由基与表面发生相互作用，一方面去除残留有机污染物，同时与表面进行化学反应以降低其疏水性。
图8 辉光放电产生的等离子体。图中展示了三种不同仪器产生的残留空气等离子体。这些仪器都能有效增加支撑表面的亲水性，但具有不同程度的可重复性，并可能损坏支撑物。需要注意的是，辉光放电装置中的等离子体通常是不均匀的，这可能导致暴露剂量显著变化，即使在同一批次中也是如此。比例尺为20毫米。
虽然可以使用剩余空气产生的等离子体（即辉光放电技术，见方案5），但为追求更高的实验重复性，我们推荐使用成分可控的等离子体系统（方案8）。等离子体处理通常采用氩气:氧气混合物，某些情况下也可使用氢气（方案7）。此外，还可引入戊胺等功能性分子来修饰表面特性，改变待分析颗粒在表面上的取向分布（方案6）(da Fonseca & Morris, 2015）。
方案5：载网的辉光放电处理
1 在电镜下仔细检查已清洁的载网，剔除任何有缺陷的样品。所有载网应确保平整、连续，且无灰尘或纤维状杂质。
2 将合格的载网放入辉光放电装置（如Edwards S150B）的真空腔室内，置于洁净玻璃片上，箔面朝上，位于台面中央位置。处理放入腔室的任何物品时必须佩戴手套，防止污染。
3将腔室抽真空至200毫托压力。
4 开启高压电源至7千伏，电流应稳定在28-30毫安范围内。
5 对载网进行精确30秒的处理。
6 处理完成后关闭高压电源，缓慢通风腔室恢复大气压。
7 将处理过的载网置于洁净玻璃培养皿中保存，并应在1小时内使用，以获得最佳效果。
在最近的一篇Nature文献中，研究报告了去甲肾上腺素转运蛋白(NET)的冷冻电镜结构，包括游离态、底物结合态以及与六种抗抑郁药结合的复合物形式。
根据文献内容，在冷冻电样品制备过程中，研究人员将2.3μl纯化的NET蛋白(浓度为1.2mg/ml)应用到经过辉光放电处理(Coolglow, SuPro Instruments)的多孔碳载网上(Quantifoil R1.2/1.3 Au 300 mesh)。
辉光放电处理后(Coolglow, SuPro Instruments)的多孔碳载网放大图，提高碳载网表面的亲水性，使蛋白质溶液能够更均匀地分布在网格表面，帮助形成更薄、更均匀的冰层，改善样品的分散性，防止蛋白质分子聚集帮助形成更薄、更均匀的冰层。
去甲肾上腺素转运蛋白(NET)的冷冻电镜图片
在辉光放电处理后，多余的液体被Vitrobot Mark IV设备去除，然后载网被迅速冷冻在液态乙烷中，以保持蛋白质的天然状态用于随后的冷冻电镜观察和结构分析。
方案6：载网的戊胺等离子体处理
1在电镜下仔细检查载网，剔除任何存在缺陷的样品。所有载网应确保平整、连续，且无灰尘或纤维状杂质。
2 将合格的载网放置在腔室内的洁净玻璃片上，箔面朝上，准确定位于电极环的中心位置（图8）。
3在腔室台面边缘放置一个装有0.5毫升戊胺的小型玻璃瓶。
4用钟罩覆盖整个系统，将腔室抽真空至低于400毫托压力。
5 启动高压电源，调整功率参数直至形成均匀稳定的等离子体（在我们使用的系统中，通常约为90伏，1.5安）。
6对载网进行30-60秒的精确处理。
7处理完成后关闭高压电源，缓慢通风腔室恢复大气压。将使用过的戊胺瓶按照适当的废物处理流程处置。
8将处理过的载网存放在洁净的玻璃培养皿中，并应在1小时内使用，以确保表面修饰效果。
方案7：氩氧等离子体处理
1在电镜下仔细检查载网，剔除任何存在缺陷的样品。所有载网应确保平整、连续，且无灰尘或纤维状杂质。
2我们使用配备自定义悬挂载网的Fischione 1070等离子体腔，该载网最多可同时容纳10个载网（图9）。在此配置中，载网与射频线圈的距离保持在约15±1厘米。为提高批次间曝光的重复性，建议始终将载网相对于等离子体源保持在相同的空间位置。或者，也可以将样品直接放在腔室内的洁净玻璃片上，箔面朝上，置于腔室的载网上。
需注意的是，未经良好屏蔽或能量过高的等离子体可能会通过溅射效应损坏金属载网；应尽量避免这种情况发生。每批次最多可处理20个载网。操作过程中应始终佩戴手套处理所有进入真空腔的物品，防止污染和指纹残留。
图9 用于表面改性的特定等离子体的产生。(A和B) Fischione Model 1070和Gatan Solarus产生具有特定成分的等离子体。(C) MRC LMB制造的定制样品台的照片（上）和示意图（下）。图中显示了两种不同的夹具设计——一种用于暴露支撑物的一侧，另一种用于暴露两侧。盖子用于防止载网在处理过程中移动。(D) 等离子体产生的示意图。
3将腔室抽真空至极高真空度（≪10^-4托）。
4 精确控制通入高纯度氩气和氧气（BOC 99.9999%）的比例为9:1，维持压力在21毫托（相当于31.0 SCCM气体流量）。
5 施加射频等离子体，正向功率控制在38瓦，反向功率保持在2瓦（Fischione 1070设备上的70%功率设置），持续时间为10-60秒（对大多数载网而言，20-30秒为最佳处理时间）。可根据实际需求优化处理时间以获得适当的亲水性（影响水溶液的铺展性和冰的厚度）。
对于含碳的非晶载网，建议通过进行几次逐步增加剂量的等离子体处理，并确定已知厚度的碳层完全被蚀刻所需的时间，从而经验性地校准碳蚀刻率。
6 对于特别薄的连续碳膜，应采用19:1的氩:氧比例和降低的功率（35瓦正向功率），缩短处理时间至5-15秒，以避免过度蚀刻。
7处理完成后排气等离子体腔，取出载网并应在1小时内使用，以获得最佳表面亲水性效果。
使用低能量氢等离子体技术，不仅可以有效去除表面污染物，还能精确控制蛋白质在石墨烯表面的吸附行为。以下详述使用Fischione 1070等离子体系统和Dominik Hunter型号20H-MD氢气发生器（直接连接到等离子体发生器的输入端口）进行氢等离子体处理的标准化流程。
值得强调的是，虽然氢等离子体处理技术具有良好的稳定性，但为最大限度地减少修饰表面后污染物的积累，建议在样品即将使用前进行此处理。这种及时性对于保持表面修饰效果至关重要。
石墨烯因其卓越的机械强度、极薄的厚度及优异的导电性，已成为冷冻电镜样品制备的理想支持材料。然而，未经处理的石墨烯表面疏水性强，不利于样品的均匀分布。氢等离子体处理是提高石墨烯亲水性的有效方案，其精确实施对样品质量具有决定性影响。
氢等离子体处理通过将氢原子引入石墨烯表面，形成部分氢化石墨烯，从而改变其表面特性。控制氢离子能量至关重要，过高的能量(>21电子伏)可能导致碳晶格结构损伤，而非预期的化学修饰。此外，处理时间的精确控制同样重要，以达到适当的亲水性同时保持石墨烯的完整性。
方案8：石墨烯载网的氢等离子体处理
1高纯度气源与设备要求：必须使用超高纯度氢气(纯度>99.999%)、全不锈钢管道及配件(严禁使用塑料部件)以及超高纯度等级调节器，确保处理过程不引入污染物。
2等离子体参数优化：线圈至样品的距离需精确控制，直接影响氢离子能量。理想情况下，应确保样品处氢离子能量低于21电子伏溅射阈值，可通过朗缪尔探针测量等离子体能量与距离的关系。或者，可通过对比处理前后石墨烯载网的完整性来验证能量参数是否合适。
3等离子体腔预处理：在正式处理前，应将等离子体腔抽真空至远低于10^-4托，4并使用100%纯氢(35瓦正向功率，
5石墨烯载网处理：将石墨烯载网安装在样品杆上，装入等离子体腔并抽真空至远低于10^-4托。使用相同设置，进行5-40秒(通常20秒)的氢等离子体处理。处理完成后应立即取出并使用，以确保表面特性不发生变化。
5 样品玻璃化技术
玻璃化技术作为冷冻电镜样品制备的关键方案，最初由Jacques Dubochet及其同事于20世纪80年代开发。该技术的核心在于通过快速冷却，使蛋白质溶液中的水保持非晶态、非结晶状态，从而形成玻璃态冰。
成功制备玻璃态冰需满足特定条件：样品必须在极短时间内（不到10^-4秒）经历约200K的温度降低，冷却速率必须超过10^5-10^6 K/s（Dubochet，1988）。由于水的导热性能较差，样品厚度必须控制在3μm以下以确保均匀快速冷却。
当前市场上存在多种手动及半自动化冷冻浸渍装置，包括FEI、Leica、EMS和Gatan等公司提供的商业设备，这些设备能够提供可控的温度与湿度环境，有效防止样品蒸发，提高制备过程的可重复性。
值得注意的是，在样品处理过程中，即使极微量的水分蒸发（相当于几百层水分子单层）也可能导致悬浮薄层中盐浓度升高，pH值变化幅度可达两倍或更多。例如，在4°C和90%相对湿度条件下，蒸发速率约为10nm/秒，这意味着在吸附和冷冻之间的2秒内，一个40nm厚的薄膜可能被浓缩至原来的一半，引起显著的渗透压和蛋白质构象变化。
因此，建议在样品载网周围维持100%相对湿度，防止冷冻前溶质浓度发生不利变化。在4°C环境下操作尤为理想，因为此温度下达到饱和所需水蒸气量较少，更容易将露点提高至环境温度，从而有效防止蒸发。
样品加载至载网后，应迅速完成后续步骤，以最大限度减少蛋白质与潜在破坏性气水界面的接触时间。
关于玻璃化程序的详细讨论可参阅Dobro、Melanson、Jensen和McDowall（2010）的综述文章。以下使用Vitrobot（FEI）的程序适用于全金和标准Quantifoil载网。
方案9：标准玻璃化程序
环境准备：用18 MΩ去离子水填充冷冻浸渍器水箱，平衡至4°C和100%相对湿度。确保环境湿度始终保持在100%，特别是在4°C条件下操作，可最大限度减少样品蒸发。
工具检查与清洁：确保使用的镊子锋利、对称对齐，并经过乙醇彻底清洁。用高纯度洗涤剂(2% Micro-90)清洁乙烷杯、载网盒架和泡沫杜瓦瓶，随后用超纯水彻底冲洗并干燥。
冷冻介质准备：在冷冻浸渍器充分平衡后(至少20分钟)，使用液氮冷却浸渍杜瓦瓶，然后用乙烷填充中央杯。注意：液态乙烷具有潜在危险性，操作时必须佩戴安全眼镜。确保乙烷温度刚好高于其熔点90K。
载网准备：通过上述氢等离子体处理使载网亲水。仅使用干净、平整、完好的载网，弯曲的载网在冷冻浸渍过程中会进一步损坏。
样品加载与吸水：将载网安装在清洁的冷冻浸渍器镊子上，在箔面上精确施加3微升蛋白质溶液(通常浓度为10-5000 nM)，注意不要让吸管尖端接触载网表面。使用预设的吸水参数进行操作，推荐不使用"等待时间"或"排水时间"，以加快过程并最小化样品与气-水界面的接触时间。
图10 载网的玻璃化和安装。（A）弯曲的载网在低温冷冻过程中会受损，导致箔片破裂。B面板展示了一个破裂的金箔示例（比例尺2μm）。载网还需要正确安装在显微镜卡盒中。C面板显示了在Krios卡盒中安装不正确且因此受损的载网。D面板中的载网安装正确。C和D面板中的比例尺为500μm。
快速冷冻：将样品浸入液态乙烷中，等待约一分钟让镊子充分冷却。随后通过液氮上方的冷蒸汽小心地将冷冻样品转移到存储盒中，释放镊子握力时轻轻让固化的乙烷从载网上剥落。将载网存放在带盖、标记的载网盒中，置于液氮存储杜瓦瓶中长期保存。
注意事项：全程避免载网与任何物体接触碰撞。任何被碰撞或弯曲的载网都应丢弃。通常，通过调整等离子体暴露时间和吸水力度来优化冰层厚度。对于亲水性不足的载网，通常会观察到载网方孔中心的冰层明显增厚，这是由于疏水表面排斥液体所致。
高分辨率数据采集
与大多数科学仪器一样，电镜及其探测系统的性能与实现此性能所需的资源投入之间存在明显权衡。鉴于结构生物学研究的根本目标是获取足够高分辨率的生物结构以明确解答科学问题，我们需要在仪器性能与数据质量、数量之间寻求最佳平衡点（图1）。
基于现有技术，我们认为将更多精力投入于样品制备优化是最具效益的策略，因为无论当前或未来，样品质量仍将是决定分辨率和密度图可解释性的关键因素。
生物样品电子显微成像主要受限于电子束导致的样品损伤。因此，电子探测器的量子效率成为影响成像质量的最重要单一因素。基于目前对探测量子效率(DQE)的理解及各种商业探测器的测量数据，我们在表1中总结了现代探测器的关键参数及推荐电子通量。这些参数结合照明条件和样品移动控制因素，构成了表2中推荐成像条件的基础。这些建议可作为研究人员在数据量、分辨率和仪器时间等因素间进行取舍的起点，并将随技术进步不断更新。
表2 MRC LMB当前推荐的数据采集设置
ᵃDQE在约80 keV时对于磷光体耦合CCD最大，但在120 keV时样品充电效应和平均自由程较低。
ᵇ像素大小受通量限制而非空间分辨率限制。
我们在此提供一套应用于配备Falcon 2探测器的Titan Krios电镜的高分辨率数据采集标准流程。基于表1和表2中的参数设置，此方案可灵活调整以适应不同样品类型及显微镜配置，确保最佳成像效果。
方案10：使用Krios/Falcon 2和全金支撑进行高分辨率数据采集
1样品装载：将样品和校准载网(PtIr、石墨化碳或类似物)装入卡盒并安装在自动加载器中。丢弃所有在处理过程中弯曲或破损的样品。
2 样品检查：将样品装入柱中，使用低倍率检查载网完整性和冰层厚度。可通过增加几百微米的离焦来提高低倍率下的对比度，以更准确判断冰层厚度。
3电镜系统校准：在选定样品后，加载校准载网并在低剂量曝光模式下执行全面的电镜对准，包括电子枪对准、聚光器和物镜光阑对准、电子束倾斜、相机增益校正以及聚光器和物镜像差校正。
4数据采集区域选择：重新加载所选样品，使用低倍率和高离焦找到所有适合数据采集的方孔。建议使用自动化软件在低倍率下创建图像拼接(图集)辅助选择。所有用于数据采集的方孔应无裂缝、结晶冰和污染。
5参数验证与优化：采集几个测试显微照片，确认冰相、厚度和颗粒分布。在曝光模式下通过电子束倾斜或观察孔边缘的条纹/亮点来精确设置焦距。检查曝光模式下电子束的照明几何形状，确保电子束呈圆形、以成像轴为中心、以孔为中心，同时包围孔周围支撑的环形区域。
6 数据采集：开始正式数据采集，可手动操作或使用自动数据采集软件。建议每采集20-30个孔检查一次焦点和照明状态。如系统安装正确，80μm方孔内的焦点变化应小于1-2μm。为验证数据质量，建议采集总显微照片的1-2%作为倾斜对照组，通常使用[0,15°]的倾斜角度和[1,3秒]的曝光时间。
采用直接电子探测器收集的每组数据均需进行严格检验，以确保样品制备和照明条件已达到最优，从而将颗粒运动降至最低。现阶段，最为有效的检验方案是对每张显微照片应用运动校正程序，如motioncorr。
在标准操作流程中，每张显微照片以电影模式采集，总辐射剂量被分割为多个独立帧。运动校正算法能够精确识别样品随时间的整体位移。该程序运算高效，使研究人员能够在成像过程中实时评估样品支撑的稳定性。
本研究在Titan Krios电子显微镜上搭配Falcon 2直接电子探测器（像素尺寸为1.7Å）进行实验，曝光时间为1秒，电子剂量为16 e/Ų。研究结果（图11）显示，在相同推荐对称条件下采集的两组数据呈现显著差异：全金支撑上的运动小于1.5Å，不足一个像素；而标准Quantifoil支撑上的运动大小则高出一个数量级。
图11 在数据收集期间或之后检测样品移动。在数据采集过程中，可以使用实时快速傅里叶变换（FFTs）检测大量的样品移动或载物台漂移。图中显示了没有载物台漂移（A）和以10 Å/秒温度引起的载物台漂移（B）的样品FFTs。显微照片C显示了推荐的对称照明，照射悬挂在全金支撑膜孔上的冷冻样品。直方图显示了在C中所示的相同对称照明条件下，全金支撑与金上无定形碳（Quantifoil）上1秒显微照片（16 e⁻/Ų）的平面移动统计。插图为直方图原点附近的放大图。
鉴于现代超稳定支撑与低漂移电镜载物台的组合使用，样品支撑的整体位移理应微乎其微。因此，显微照片运动跟踪算法不仅可用于常规检测，还可作为诊断工具，帮助研究人员识别数据采集设置错误、载物台漂移或载网损坏等问题，从而确保获取最高质量的电镜数据。
L.A. Passmore, C.J. Russo, Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM, Methods in Enzymology,2016
来源于老千和他的朋友们，作者孙千
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来源：芯片测试赵工