摘要：随着生物医药技术和肿瘤免疫疗法的不断发展，抗体药物在肿瘤治疗领域发挥越来越重要的作用。双特异性抗体（BsAb）是指含有2种特异性抗原结合位点的抗体，能结合2种不同的细胞表面抗原或同一抗原的2种表位[1-2]。大部分已上市的BsAb适应证为肿瘤[3]，BsAb结

随着生物医药技术和肿瘤免疫疗法的不断发展，抗体药物在肿瘤治疗领域发挥越来越重要的作用。双特异性抗体（BsAb）是指含有2种特异性抗原结合位点的抗体，能结合2种不同的细胞表面抗原或同一抗原的2种表位[1-2]。大部分已上市的BsAb适应证为肿瘤[3]，BsAb结构复杂，作用特点多样，不良反应机制尚未完全明确。根据新药注册相关法规及技术要求，新药申请临床研究之前需进行非临床安全性研究，为临床研究的起始剂量选择与安全监测提供支持。

1 抗肿瘤BsAb的非临床研究考虑要点

1.1 靶点选择与动物模型

BsAb的非临床安全性评价动物种属选择通常基于药效实验，需要选择与2个靶点都具有高亲和力的相关动物种属[4]，相较于单特异性抗体考虑因素更为复杂。缺乏相关动物种属时，需要制备替代抗体或使用人源转基因动物进行安全性评价，应充分验证可行性，再决定是否采用替代抗体和转基因动物的结果。

1.2 免疫原性

为了提高BsAb的药效和半衰期，通常会在其结构中引入非天然肽段[5]。小分子BsAb容易发生聚集，增加产生免疫原性的风险[6]，降低药物的安全性，并可能导致严重的药物相关毒性反应或过敏反应[7]。因此，免疫原性评价是BsAb非临床安全性研究的重要组成部分。

1.3 非临床药动学

BsAb的剂量线性特征与化学小分子药物不同，可能与靶点介导的药物处置有关，剂量线性的研究有助于确定药物的安全性和有效性[8]。BsAb通常通过注射途径给药，考虑到患者依从性等原因，非静脉注射给药途径的生物利用度评估也是安全性评价的一部分[9]。BsAb的分布和消除特性，以及是否进行了相关的代谢和排泄研究，对评估其安全性至关重要[10]。对于CD3靶点的BsAb，在非临床药动学研究中建议逐步增加剂量，以降低由于快速活化T细胞可能引起的不良反应[11]。

1.4 细胞因子释放综合征（CRS）

CRS是BsAb最常见的不良反应，特别是针对CD3靶点的BsAb[8,12]，轻症包括发烧、头痛等，重症包括低血压、毛细血管渗漏、循环衰竭等[13]，限制了BsAb的临床应用[14]。在非临床安全性评价中通常通过检测白细胞介素-6（IL-6）、IL-10、IL-2、γ干扰素（INF-γ）等细胞因子含量评价细胞因子释放综合征[15]。

1.5 首次临床剂量

基于体外实验数据的剂量预测方法对于确定安全的首次人体剂量至关重要。欧洲药品管理局（EMA）发布的指导原则建议对于高风险药物考虑基于最低预期生物效应剂量进行起始剂量的估算。通常通过细胞毒性实验、T细胞活化和增殖实验以及细胞因子释放实验等进行评价，其中对应于最大效应20%（EC20）的浓度通常被认为代表最低预期生物效应[16]。

1.6 其他

在BsAb的非临床研究中，需要评估性别是否对药物的安全性和药动学特征产生影响[17]。BsAb可能会影响其他药物的代谢，特别是那些通过细胞色素P450酶（CYP450）代谢的药物，因此在非临床阶段需要评估潜在的药物相互作用[18]。

在上述关注要点中，选择合适的实验系统对于能否准确预测临床试验出现的不良反应最为重要。

2 抗肿瘤BsAb的非临床安全性评价实验系统

BsAb药物非临床安全性评价的实验系统主要包括工程化细胞系、患者来源的细胞、人源化异种移植物（PDX）模型、啮齿类动物、食蟹猴等[19]。

2.1 啮齿类动物

小鼠价格低、繁殖周期短、基因易修饰的特点使其成为抗肿瘤BsAb非临床安全性评价常用的动物[20]。应用最多的是共移植有功能性人类免疫系统和患者来源的肿瘤组织的NOD/SCID小鼠[21]，常用的功能性人类免疫系统移植物是人外周血单核细胞（PBMCs）。该实验系统是研究肿瘤和免疫系统相互作用的重要工具，但是需花费至少3个月的时间建模，且肿瘤移植成功率较低[22]。

由于小鼠和人细胞因子的交叉反应性的限制，人源免疫系统NOD/SCID小鼠不能建立先天免疫，不能完全重现人类免疫系统[23]。Martinez等[24]和Janke[25]等对现有重度免疫缺陷小鼠进行改造产生了MISTRG小鼠和NSG-SGM3小鼠，以促进人先天免疫系统的重建。但这些小鼠模型有肥大细胞增生等问题，尚且没有进入商业化生产中[26]。

2.2 非人灵长类动物

非人灵长类动物如食蟹猴，与人类免疫细胞群、肿瘤免疫靶点类似，与抗体药物的组织交叉反应率高，可以很好地预测临床出现的毒性反应[27-28]，常用于抗体药物的药动学实验和重复给药毒性实验[29]。通常采用健康食蟹猴进行安全性评价时，由于其免疫系统处于相对静息状态，靶点表达水平低，无法完全预测肿瘤患者出现的不良反应[30]。为此，Zheng等[31]通过单碱基编辑的方式获得了免疫系统严重受损的食蟹猴，并成功移植了乳腺癌细胞。此模型弥合了动物和人类之间的差距，可以显著提高非临床研究的有效性。

2.3 体外替代实验系统

传统人源化细胞系的二维模型无法模拟免疫治疗的生物学机制的复杂性，动物模型无法概括靶抗原在人体的生理相关水平和模式。Kerns[32]和Kroll等[33]报道了器官芯片模型，将微工程与培养的原代人类细胞相结合重建了复杂的多因素微环境和器官的功能，评价了多种BsAb的安全性，克服了上述限制。Teigeira等[34]使用了三维培养的肿瘤细胞实验系统，可以测试减轻细胞因子释放综合征的药物产生的影响，提供了有临床意义的数据。

3 已上市抗肿瘤BsAb非临床安全性评价案例解读

从2007年至今，已有11个抗肿瘤BsAb获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，相应的非临床安全性研究应用的实验系统及主要的评价指标见表1。

从表1可见：在非临床实验系统方面，已上市的BsAb除catumaxomab、tebentafusp和candonilimab外均利用了重度免疫缺陷小鼠建立肿瘤模型。安全性研究中用到的重度免疫缺陷小鼠包括BALB/c裸鼠、NOD/SCID小鼠、NSG小鼠、BRG小鼠等。考虑到雌性小鼠建立皮下肿瘤成功率高、免疫系统反应强[53]，部分产品仅使用了雌性小鼠评估安全性，未研究性别与安全性是否相关。

此外，与食蟹猴有组织交叉反应的BsAb非临床安全性研究也开展了食蟹猴单次给药试验、重复给药毒性试验和药动学试验。通过观察临床症状，测定摄食量、体质量、体温，进行临床病理学、组织病理学检查，收集血液学样本，检测细胞因子水平、半衰期、免疫细胞分型，并分析生物分布来评价其安全性。

已上市的11个抗肿瘤BsAb中9个都靶向CD3，这9个产品的非临床安全性研究均检测了IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α等细胞因子含量以预测临床中可能出现的细胞因子释放综合征。由于靶抗原不仅在肿瘤细胞上表达，也在正常细胞上低表达，安全性研究中也需要评估靶向正常组织的毒性。常用的评价方法是在体外检测BsAb与不同靶蛋白表达量细胞的结合能力或EC50。

catumaxomab不与包括非人灵长类在内的标准动物物种的EpCAM和CD3结合，所以非临床研究采用鼠源替代分子BiLu进行体内实验[35]，毒理学参考价值低[54-55]。blinatumomab仅在黑猩猩中有组织交叉反应[56]，但考虑到动物伦理问题，研究迅速过渡到使用替代/同源模式的小鼠实验系统。tebentafusp是全球第一款抗肿瘤免疫激动单克隆T细胞受体（ImmTAC）[57]。动物实验系统被认为不适合ImmTAC测试，在动物身上观察到的免疫反应可能无法预测人类的反应。替代分子的T细胞受体在特异性和与人类T细胞受体的结合特征方面不同[43]。ICH S6和S9规定，当没有相关种属时，考虑采用体外实验系统。candonilimab则使用了双人源化PD-1+-CTLA4的C57BL/6小鼠实验系统进行安全性评估。teclistamab的非临床安全性研究中还使用了Vk*MYC小鼠模拟复发/难治性多发性骨髓瘤[58]，该小鼠模型的生物学和临床特征与人类疾病高度相关，更好地预测临床安全性。为了研究glofitamab的Fc段介导的毒性作用，Frances等[59]用雌性人源FcRn Tg32小鼠评估其安全性。

4 结语与展望

综上所述，BsAb的结构类型多，作用机制广泛。随着各种新技术的引入，BsAb的风险认知也在不断发展，对其非临床安全性研究提出了新的要求。抗肿瘤BsAb最常见的不良反应是CRS，指超过150种炎症介质参与的级联放大的系统性免疫应答，以发热和多器官功能性障碍为特征的急性全身性炎症综合征。目前已有的解决方案包括糖皮质激素或抗IL-6抗体提前给药、降低CD3亲和力、皮下给药、使用剂量递增方案等[60]。这提示在开展非临床安全性研究时，应关注实验系统尽可能地模仿人类免疫系统，结合免疫反应的剂量相关性、抗药抗体、细胞因子释放量、免疫毒性指标的变化以及组织病理学结果，早期识别和评估BsAb的潜在免疫毒性风险，综合判断药物的非临床安全性，为临床试验的设计和药物的最终批准上市提供重要的安全数据。

来 源：赵长新，耿兴超，黄芝瑛．抗肿瘤双特异性抗体非临床安全性评价关注要点 [J]. 药物评价研究, 2025, 48(5): 1362-1368.

来源：天津中草药一点号