摘要：纤维素的降解是自然界中最重要的反应之一，也是生物质转化为燃料和化学品的核心过程。然而，纤维素的微纤维结构以及它与植物细胞壁其他成分的复杂相互作用，使得酶促转化面临着巨大的挑战。在这项研究中，我们通过挖掘一种专门降解木质纤维素的微生物群落中的宏基因组“暗物质”(

研究论文

● 期刊：Cell (IF:45.5)

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●原文链接:

https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(25)00155-2

● 第一作者：Gavin A. Kuziel, Gabriel L. Lozano

● 通讯作者：Seth Rakoff-Nahoum （

● 发表日期：2025-3-7

● 主要单位：

摘要Summary

纤维素的降解是自然界中最重要的反应之一，也是生物质转化为燃料和化学品的核心过程。然而，纤维素的微纤维结构以及它与植物细胞壁其他成分的复杂相互作用，使得酶促转化面临着巨大的挑战。在这项研究中，我们通过挖掘一种专门降解木质纤维素的微生物群落中的宏基因组“暗物质”(未分类、功能未知的DNA)，发现了一种金属酶，它能氧化性地裂解纤维素。这种金属酶通过外切型机制作用于纤维素，具有C1位的区域选择性，只生成纤维二糖酸(cellobionic acid)作为产物。其晶体结构显示，催化铜离子被埋藏在一个紧凑的果冻卷结构中，并具有一个扁平的纤维素结合位点。这种金属酶呈现同源二聚体结构，使得一个亚基在反应过程中生成过氧化氢，而另一个亚基则与纤维素进行有效的相互作用。表达这种金属酶的改造木霉(Trichoderma reesei)菌株的分泌物，在工业条件下，显著提高了预处理木质纤维素生物质中的葡萄糖释放，展示了其生物技术应用潜力。这一发现改变了我们对细菌氧化还原酶系统的现有认知，特别是它们在解决生物质降解的顽固性方面的作用。此外，这一发现还为农业工业废料的转化提供了新的途径，有助于推动向可持续和生物基础经济的转型。

结果Results

人类肠道微生物群对膳食和药用酚糖苷的利用情况概述

为探究人类肠道菌群代谢植物次级代谢物（PSM）糖苷的能力，我们选取了分类学上广泛且具有代表性的肠道菌群成员，以其利用糖苷作为能量源的能力作为代谢活性的可量化指标。为初步评估肠道菌群代谢膳食及药用糖苷的广谱化学物质功能潜力，我们首先采用了一组简单的芳基糖苷、生氰糖苷和香豆素糖苷。值得注意的是，虽然这些糖苷均通过相同键型（β1）连接相同糖基（D-葡萄糖）（图1A），但各化合物的苷元存在微妙而显著的化学修饰差异，如醇基碳链长度（熊果苷vs.天麻素）、醛基与醇基功能化（水杨苷vs.螺旋糖苷）、芳香甲醇修饰的取代位点（邻位水杨苷vs.对位天麻素）或苷元连接链长度（熊果苷vs.红景天苷）（图1A）。肠杆菌科成员（如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、葡萄牙柠檬酸杆菌（弗氏柠檬酸杆菌复合体）、肠道沙门氏菌）及其他兼性肠道厌氧菌（如粪肠球菌和屎肠球菌）表现出两种极端表型：要么作为"广谱利用者"高效代谢所有糖苷（肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和屎肠球菌；图1B橙色），要么完全无法利用任何糖苷（大肠杆菌、葡萄牙柠檬酸杆菌和肠道沙门氏菌；图1B深蓝色），这与既往研究报道的这些类群缺乏或隐匿糖苷代谢能力的结论一致。

图1 | 人类肠道微生物组膳食酚类苷利用的研究概况

(A) 膳食和药用酚类苷的种类。每种苷类都通过相同的糖苷键（β1）与相同的糖（D-葡萄糖）连接。每个苷元部分具有细微但独特的化学修饰（红色标注），例如醇基的碳链长度、醛基与醇基的官能化差异、芳香甲醇的取代位置，或苷元连接臂的长度。

(B) 人类肠道微生物成员在苷类（或葡萄糖，浓度均为15 mM）作为唯一碳源时的生长热图。生长量以每个菌株48小时生长曲线下面积（AUC单位）表示。为在不同菌株和底物间统一比较，从每种菌株在葡萄糖或苷类上的总生长中减去因培养基成分代谢产生的背景生长。深蓝色表示最大生长量。颜色说明：橙色表示能利用多数或全部苷类的“广谱型”细菌；藏青色和绿色表示不能利用苷类的不同肠道菌群类群；蓝绿色表示能利用特定苷类的“专一型”细菌；粉色表示苷类利用能力存在菌株水平差异的示例。(B) 中的数据来自一次生物学重复，技术上重复三次。

肠道梭菌类（如乳酸杆菌属 Lactobacilli、Hungatella hathewayi、Clostridium symbiosum、C. scindens、P. hiranonis、C. cadaveris、C. sporogenes 和 Coprobacillus cateniformis）以及肠道放线菌类（如Bifidobacterium longum）在该苷类筛选体系中表现出“广谱型”（可利用全部或大多数苷类）或“不可利用/潜在利用”的特征（图1B，绿色）。然而，在其他肠道梭菌和厚壁菌门成员中，覆盖 Lachnospiraceae、Clostridiaceae 和 Erysipelotrichales 等多个分类群，我们观察到各自独特的苷类利用模式。Ruminococcus gnavus对特定苷类（熊果苷、天麻苷、水杨苷和红景天苷）表现出相似的生长能力，但对苦杏仁苷无生长，并在使用龙胆苷（esculin）时表现出菌株水平的差异（R. gnavus 2_1_58FAA 与 CC55_001C）（图1B，粉色字体）。其他肠道梭菌成员则表现出对特定苷类的出人意料的专一性（图1B，蓝绿色）。例如，Longicatena innocuum 可专一性利用熊果苷、龙胆苷、柳苷和水杨苷，但对红景天苷或苦杏仁苷无生长（图1B）。Blautia massiliensis 对熊果苷表现出特异性偏好（相比其他芳香酚苷类生长更好），而 Faecalimonas umbilicata 则可利用熊果苷和水杨苷，但无法利用其他芳香酚苷类。

在人类肠道拟杆菌目（Bacteroidales）成员中——这是人类肠道微生物组中主要的革兰氏阴性菌群之一——我们观察到了糖苷利用方面的意外差异。B. fragilis S36 L11、B. eggerthii DSM、B. vulgatus ATCC 和 B. dorei 9_1_42FAA 对每种糖苷均表现出无法利用或潜在利用的特征（图1B，藏青色）。而 B. ovatus CL03T12C18 及各个副拟杆菌属（Parabacteroides）成员，包括 P. goldsteinii CL02T12C30、P. distasonis 31_2、P. johnsonii CL02T12C29 和 P. merdae CL03T12C32，则普遍能够利用各类糖苷（除了 helicin，我们仅在 H. hathewayi、C. tertium、C. innocuum 和肠球菌中发现其可被利用；图1B，橙色）。相比之下，我们发现拟杆菌属（Bacteroides）的某些成员在特定糖苷的利用上具有独特且菌株特异性的专化能力（图1B，青绿色）。例如，B. salyersiae DSM 和 B. nordii CL02T12C05 仅能利用 esculin 和 amygdalin，而 B. finegoldii DSM 则仅能利用 esculin（图1B）。与之相反，Bacteroides uniformis ATCC 在芳香糖苷（如 arbutin、salicin、gastrodin 和 salidroside）中生长良好，但在结构更复杂的 esculin 或 amygdalin 中生长有限或完全不生长。B. caccae ATCC 能利用所有简单糖苷（同样不包括绣线菊苷（helicin）），但不能利用熊果苷（arbutin）。综上，我们的数据表明在人类肠道微生物组中的梭菌纲（Clostridia）、厚壁菌纲（Erysipelotrichia）和拟杆菌目中，糖苷的利用存在意想不到的多样性。其中某些成员表现为“全或无”型的糖苷利用方式，而另一些则对结构相似但酚类苷元修饰不同的植物次级代谢物（PSMs）具有差异性利用能力。

人类肠道拟杆菌目在酚类糖苷利用上的菌株水平差异

鉴于拟杆菌目（Bacteroidales）在人体肠道微生物组中的丰度，植物性饮食与拟杆菌属（Bacteroides）在健康中的关联，以及我们发现拟杆菌目对特定与健康相关的植物来源糖苷存在差异性利用，我们进一步深入研究了肠道拟杆菌目对酚类糖苷的利用能力。通过分析来自18个物种的52株拟杆菌属和 Parabacteroides 菌株对一组简单糖苷的利用能力，我们揭示了糖苷利用在菌株水平以及苷元修饰水平上的广泛差异（图2A）。总体而言，同一物种的菌株在糖苷利用上呈现相似的模式。例如，B. ovatus、B. xylanisolvens 及各副拟杆菌属成员的每一个菌株均表现为广谱利用者，能够利用我们设定的所有简单糖苷。同样，B. vulgatus 和 B. dorei 在物种层面上均无法利用任何糖苷（图2A）。然而，在其他拟杆菌属中，我们观察到特定糖苷的菌株水平差异。例如，虽然所有 B. thetaiotaomicron 菌株都专门利用 esculin 和 amygdalin，但在 salicin 利用的生长动力学方面存在菌株间差异（Bt 1_1_6 与 Bt VPI，图2B）。所有 B. fragilis 菌株普遍无法利用酚类糖苷，唯一的例外是 B. fragilis CL05T00C42，它能特异性利用 esculin（图2C）。B. uniformis ATCC 和 D20 对芳香糖苷的利用具有专一性，而 B. uniformis CL03T00C23 在所有酚类糖苷中均无生长（图2D）。类似地，B. caccae ATCC 能利用大多数糖苷，但 B. caccae CL03T12C61 则无法利用任何一种糖苷（图2E）。综上，我们的研究结果揭示了人类肠道拟杆菌属中糖苷利用存在显著的菌株水平差异及苷元修饰层面的差异。

图2 | 人类肠道拟杆菌目在膳食酚类糖苷利用上的菌株水平差异

（A）拟杆菌目在利用酚类糖苷（或葡萄糖，浓度均为15 mM）时的生长热图。生长情况通过每条 48 小时细菌生长曲线下的面积（AUC 单位）计算。深蓝色代表最大生长水平。颜色标注说明：B. thetaiotaomicron的菌株水平差异为绿色，B. fragilis 为紫色， B. uniformis 为蓝色， B. caccae为粉色。（B）Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 与 1_1_6 在以葡萄糖或酚类糖苷为唯一碳源（15 mM）时的生长情况。生长通过每条 48 小时细菌生长曲线下的面积计算。（C）B. fragilis CL05T00C42 与 S13L11 在以葡萄糖或酚类糖苷为唯一碳源（15 mM）时的生长情况。生长通过每条 48 小时细菌生长曲线下的面积计算。（D）B. uniformis ATCC 8492 与 CL03T12C37 在以葡萄糖或酚类糖苷为唯一碳源（15 mM）时的生长情况。生长通过每条 48 小时细菌生长曲线下的面积计算。（E）B. caccae ATCC 43185 与 CL03T12C61 在以葡萄糖或酚类糖苷为唯一碳源（15 mM）时的生长情况。生长通过每条 48 小时细菌生长曲线下的面积计算。（A）中高通量筛选数据来自一次生物学重复，包含技术三重复；（B）至（E）中的数据为两次生物学重复的代表性结果，每次重复均包含技术三重复；（B）至（E）中误差棒表示平均值 ± 标准差（SD）。

人类肠道拟杆菌属中不同的酚类糖苷利用系统

在拟杆菌属中，我们揭示了芳香糖苷利用的独特模式，提示其在代谢与健康相关的植物小分子方面存在差异性的机制。因此，我们进一步尝试解析拟杆菌属中芳香糖苷利用的机制基础。我们以广谱利用这些底物的 B. ovatus ATCC 为研究对象，采用正向遗传学策略，结合转座子插入诱变与新一代测序（Tn-seq），以确定其芳香糖苷利用的遗传基础。通过比较在熊果苷与葡萄糖条件下导致功能丧失的 Tn 插入位点，我们鉴定出 67 个在 arbutin 中表现出显著适应性劣势的基因（log₂ 倍数变化 ≥ 1，p

图3 | 人类肠道拟杆菌之间的不同酚类糖苷利用系统

(A) B. ovatus ATCC在熊果苷（15 mM）或葡萄糖（15 mM）作为唯一碳源的条件下进行的Tn-seq实验。突出显示了一个包含五个基因的基因座，每个基因都有标注。 (B) 拟杆菌卵磷脂（Bacteroides ovatus）的糖苷利用基因座。 (C) B. ovatus WT、ΔgghR、ΔgghA、ΔgghB、ΔgghC或ΔgghD在各自的芳香糖苷（15 mM）作为唯一碳源的条件下生长。请注意，在每种条件下，每个突变体的生长曲线都有重叠。 (D) B. ovatus WT、ΔgghR、ΔgghA、ΔgghB、ΔgghC或ΔgghD在棉花糖（上）和海藻糖（下）（15 mM作为唯一碳源）中生长。请注意，除了Bo ΔgghD外，所有突变体的生长曲线在这两种底物中都有重叠。 (E) B. uniformis ATCC在熊果苷（15 mM）或葡萄糖（15 mM）作为唯一碳源的条件下进行的Tn-seq实验。突出显示了一个包含四个基因的基因座，每个基因都有标注。 (F) 通过Tn-seq在B. uniformis中鉴定的糖苷利用基因座。 (G) 在B. uniformis中鉴定的次要糖苷利用基因座。 (H) B. uniformis WT、ΔgshD、ΔgshDΔgghC、ΔgshDΔgshG或ΔgshDΔgshGΔgghC在每种指定的芳香糖苷（15 mM）作为唯一碳源的条件下生长。在(A)和(E)中，倍数变化和p值是通过合并两个生物学重复计算得出的。在(C)、(D)和(H)中，数据代表了两到三个生物学重复，每个重复包含三次技术重复。在(C)、(D)和(H)中，误差条表示均值 ± 标准差（SD）。

我们接下来试图确定芳香糖苷利用的遗传基础，重点研究了糖苷专一性较强的B. uniformis。与能够利用芳香糖苷、香豆素糖苷和氰苷糖苷的B. ovatus相比，B. uniformis专门利用芳香糖苷，且在芳香糖苷中的生长产量明显高于在葡萄糖中的生长产量（图2A和2D）。我们采用与B. ovatus相同的方法，构建了B. uniformis的全基因组转座子突变文库，并在葡萄糖与熊果苷中进行选择后进行了Tn-seq实验（图3E）。与B. ovatus不同，转座子插入位点在一个由四个基因（BACUNI_00922–BACUNI_00919）组成的操纵子中，这些基因在熊果苷中丧失适应性，其中编码GH3家族成员的BACUNI_00919是最具统计学意义的失去适应性的Tn插入（图3E）。我们将这个操纵子命名为糖苷专一性水解酶gsh，包含酯酶（gshA，BACUNI_00922；gshB，BACUNI_00921；gshC，BACUNI_00920）和一个GH3家族成员（gshD，BACUNI_00919）（图3F）。为了确定B. uniformis中gsh操纵子中每个基因对芳香糖苷利用的需求，我们为操纵子中的每个基因生成了非极性删除突变体。与B. ovatus的ggh通用型糖苷利用基因座不同，在B. uniformis的gsh操纵子中，仅删除GH3基因gshD就导致了糖苷利用的受损（图S2A和S2B）。重要的是，与B. ovatus中删除GH16基因gghC导致芳香糖苷利用完全缺失不同，删除B. uniformis中的GH3基因gshD仅导致芳香糖苷生长部分缺陷（图S2A），这表明与通用型的B. ovatus不同，B. uniformis利用多个GH酶来利用这些底物。

为了识别与gshD协同作用的基因，以便在专一性B. uniformis中利用芳香糖苷，我们在熊果苷选择下，对Bu ΔgshD背景进行了合成Tn-seq筛选。该筛选发现了两个基因的Tn插入位点，分别是BACUNI_01042（gshG，GH3家族成员）和BACUNI_0952（gghB，一个与B. ovatus ATCC中发现的烟酰胺依赖的氧化还原酶同源的基因，位于Bo GH16基因gghC的同源基因上游）（图3G；表S2）。接下来，我们生成了一系列单基因、双基因和三基因删除菌株，缺失了gshD、gshG和gghC的组合。仅删除Bu GH3基因gshG或Bu GH16基因gghC并未显示出芳香糖苷利用的缺陷，证明了GH3基因gshD在芳香糖苷利用中的协同需求（图S2C）。

比较B. uniformis中gsh GH3基因删除组合对每种芳香糖苷的利用情况揭示了显著发现。删除Bu GH3 gshD和Bu GH3 gshG（Bu ΔgshDΔgshG）在熊果苷上的生长较Bu ΔgshD单独突变体受损（图3H），但显著保留了对该芳香糖苷的部分利用。相比之下，删除Bu GH3 gshD和Bu GH16 gghC（Bu ΔgshDΔgghC）则表现出完全的熊果苷利用缺陷，表明在B. uniformis中，利用熊果苷需要一个由三种GH酶组成的系统，其中Bu GH16 gghC对熊果苷利用的贡献大于Bu GH3 gshG（图3H）。与熊果苷类似，这种三种GH酶系统对于利用胃苷（其功能化为对位羟甲基化）也至关重要，而熊果苷则是对位羟基化的。与熊果苷和胃苷的三种GH酶需求相比，Bu GH16 gghC而非Bu GH3 gshG是利用水杨苷所必需的。然而，对于B. uniformis利用红景天苷（salidroside），我们看到相反的结果，因为Bu GH3 gshG而非Bu GH16 gghC与Bu GH3 gshD共同作用，才能利用这种芳香糖苷。综合来看，我们的研究表明，尽管B. ovatus只使用一种GH酶来利用芳香糖苷，B. uniformis则通过独特的GH3和GH16组合来利用特定的PSM糖苷。

人类肠道拟杆菌中用于酚类糖苷代谢的专一性酶

在糖苷专一性B. uniformis中，利用不同芳香糖苷所需的GH酶对的发现，表明Bu GH3酶可能专一性地或专门用于不同的酚类糖苷。Bu GH3 gshG对红景天苷而非水杨苷的需求表明该酶对特定糖苷具有专一性。为了验证这一假设，我们首先在B. vulgatus中过表达了Bu gshG，而B. vulgatus无法在红景天苷或水杨苷上生长（图2A和S3A）。过表达Bu GH3 gshG后，与水杨苷相比，在红景天苷上的生长速率和产量得到了增强，而水杨苷虽然作为底物也被利用，但程度较低（图4A）。这表明，Bu GH3 gshG对红景天苷的水解专一性可能是通过这种酚类糖苷的独特 苷元（非糖部分）与水杨苷的差异所编码的。为了明确测试Bu GH3 gshG的底物专一性，我们纯化了重组的Bu GH3 GshG（图S3B），并测量了其对水杨苷和红景天苷的水解活性。Bu GH3 GshG对红景天苷的催化转化率是水杨苷的10倍（图4B）。这些数据揭示了B. uniformis的GH3 GshG展示了基于糖苷 苷元部分的结构差异的底物专一性。

图4 | 人类肠道拟杆菌中用于酚类糖苷代谢的专门酶

(A) 补充了gshG的B. vulgatus野生型菌株在葡萄糖、水杨苷或红景天苷作为唯一碳源时的生长情况。(B) gshG水解水杨苷或红景天苷的Michaelis-Menten动力学。(C) B. uniformis野生型和ΔgshG突变株在拟杆菌最小培养基中使用龙胆二糖生长的情况。(D) 重组GshG对水杨苷、红景天苷或八种二糖的水解百分比，生成相应的苷元或单糖。(E) 补充了gshD的B. vulgatus野生型菌株在葡萄糖、水杨苷或红景天苷作为唯一碳源时的生长情况。(F) GshD水解水杨苷或红景天苷的Michaelis-Menten动力学。(G) 重组GshD对水杨苷、红景天苷或二糖（如图所示）的水解百分比，生成相应的苷元或单糖。所有碳源浓度为15 mM。在(A)、(C)和(E)中，数据代表了两个生物学重复，每个重复包含三次技术重复。在(B)和(F)中，数据来自一个生物学重复，包含三次技术重复。在(D)和(G)中，数据代表了两次独立实验，每次包含三次技术重复。在所有面板中，误差条表示均值 ± 标准差（SD）。

对于GH16家族成员gghC（在Bo和Bu之间保守），我们展示了其在B. ovatus中对芳香糖苷和二糖（如海藻糖和棕榈糖）的利用作用，表明该GH16成员对PSM糖苷和二糖具有广泛的水解活性（图3C和3D）。因此，我们接下来寻求确定B. uniformis GH3（对芳香糖苷的利用是必需的）是否也需要用于二糖的利用。我们发现Bu ΔgshG在利用龙胆二糖时部分缺陷，表明Bu GH3 gshG对该β1,6葡萄糖-葡萄糖同二糖的利用是必需的（图4C和S3C）。纯化的重组Bu GH3 GshG蛋白水解了龙胆二糖和β1,4葡萄糖-葡萄糖同二糖纤维二糖，其效率与水解红景天苷相当（图4D）。这些数据表明，Bu GH3 gshG使得B. uniformis能够利用芳香糖苷（如红景天苷、木通苷和胃白苷，水杨苷的利用较少）以及二糖龙胆二糖，因此能够水解芳香糖苷和二糖。

我们接下来旨在确定Bu GH3 gshD的特异性，该酶在B. uniformis中对每种芳香糖苷的利用是必需的（图3H）。在B. vulgatus中过表达Bu GH3 gshD使其具备了与这些酚类糖苷相似的利用能力（图4E），与Bu GH3 gshG对红景天苷的特异性相比（图4A）。与Bu GH3 gshG不同，缺乏Bu GH3 gshD不会影响B. uniformis对二糖的利用（图S3C）。这表明Bu GH3 gshD可能专门用于PSM糖苷的代谢。事实上，我们发现Bu GH3 gshD是肠道细菌中GH3酶的一种独特分支，与Bu GshG不同（图S4D），并且只存在于B. uniformis和P. distasonis等拟杆菌科细菌中（图S3E）。为了明确测试Bu GH3 gshD的底物特异性，我们纯化了Bu GH3 gshD（图S3F），并测量了其对水杨苷、红景天苷以及一系列二糖的水解活性。Bu GH3 gshD对水杨苷和红景天苷的水解活性相当（图4F），但未能水解任何二糖（图4G）。综上所述，我们证明了B. uniformis含有具有底物特异性的GH3酶，这些酶的特异性依赖于每种底物的苷元部分的独特结构差异（Bu GH3 GshG），并且可能专门用于PSM糖苷的水解（Bu GH3 gshD）。

拟杆菌的多样化酚类苷元的释放

我们的数据已经证明了在主要的人类肠道微生物成员B. uniformis中，芳香糖苷的利用和水解由一个专门的代谢系统介导。负责芳香糖苷代谢的B. uniformis GH酶预计定位于外膜。因此，我们接下来问是否B. uniformis对芳香糖苷的水解会导致一系列芳香苷元的释放和胞外可用性。为了测试这一点，我们通过液相色谱质谱（LC-MS）在B. uniformis在补充每种芳香糖苷的培养基中生长后的上清液中测定了不同苷元的存在。对于每种芳香糖苷——木通苷、红景天苷、胃白苷、海螺苷和水杨苷——B. uniformis分别释放了相应的苷元，包括对苯二醇、胃白苷素、酪氨酸、香豆醛和水杨醇（图5A）。

图5 | 由拟杆菌属释放多种膳食来源的芳香族游离苷元

(A) 含各芳香族苷的细菌培养物上清液经甲醇-水提取后的LC-MS提取离子色谱（EIC）比较图。黑色轨迹对应每种苷类的EIC，粉色轨迹对应每种游离苷元的EIC。粉色轨迹中与黑色轨迹重叠的峰代表在电离源处由苷类碎裂产生的游离苷元，为技术伪影（非生物学现象）。

(B) 常见膳食植物多酚苷的示意图。图中游离苷元以与葡萄糖（蓝色圆圈）和/或鼠李糖（绿色三角）糖基化的形式表示。

(C) 各多酚苷在补充至细菌培养物中8小时后，经甲醇-水提取所得样品的LC-MS EIC比较图。黑色轨迹对应各苷类的EIC，粉色轨迹对应各游离苷元的EIC。粉色轨迹中与黑色轨迹重叠的峰为苷类在电离源碎裂所形成的游离苷元，为技术伪影。

接下来我们探究了 B. uniformis 是否能水解并释放更广泛植物次生代谢物（PSM）来源的苷元，研究范围扩展至膳食中丰富、且与多种健康与疾病相关的多酚苷类。为此，我们构建了一组多酚苷标准物，与之前的芳香族苷类似，这些苷元均通过 β1-连接与葡萄糖结合，但其苷元在化学结构上具有高度多样性，涵盖类黄酮（黄酮醇类：芸香苷；黄烷酮类：柚皮苷；黄酮类：绿原苷；异黄酮类：染料木素和大豆苷元）、二氢查尔酮类（苹婆苷）、苯乙烯类（白藜芦醇苷）以及木脂素类（松脂素双葡萄糖苷）（图 5B）。通过靶向 LC-MS 分析，我们发现 B. uniformis 能从每种多酚苷底物中释放出预测的脱糖苷元产物（图 5C）。这些结果共同表明，B. uniformis 对芳香族苷的代谢能够释放出多种单酚和多酚类苷元。

由拟杆菌属介导的多酚苷的生物活化生成抗生素

在明确了植物苷类专性菌 B. uniformis 能广泛代谢多种酚类苷并释放结构多样的苷元后，我们进一步探究了这些植物来源的小分子在哺乳动物肠道中对微生物-微生物及微生物-宿主功能的潜在影响。在植物中，植物外切糖苷酶对酚类苷的脱糖作用可释放出苷元，这些苷元在抵御病原微生物方面发挥着多种重要功能。因此，我们提出问题：B. uniformis 从不同苷类中释放出的各种苷元是否会激活对人体肠道病原菌的抗菌功能。为验证这一假设，我们评估了苯基或多酚苷及其由 B. uniformis 释放的相应苷元（见图 6A）对一组人类肠道病原菌（包括多重耐药（MDR）和机会致病菌属）适应度的影响。筛选结果显示，特定的多酚苷在不同肠道病原菌中表现出差异化的适应度效应。例如，异黄酮大豆苷元（daidzein） 是由 B. uniformis 从大豆苷（daidzin）中释放出的苷元，对多种肠道病原菌具有促生长作用，而黄酮苷类木犀草苷(cymaroside)的苷元 木犀草素（luteolin） 对肠球菌（E. faecium）具有抗菌活性（图 6A）。最值得注意的是，我们发现两种来源于多酚苷的苷元具有强效的抗菌能力：根皮素酚(phloretin)（由苹果中丰富的二氢查尔酮苷 phloridzin 衍生）和 白藜芦醇(resveratrol)（由葡萄及传统中药植物如虎杖中的苷白藜芦醇苷(polydatin)衍生），这两种苷元对 Clostridioides difficile M7404 菌株具有显著抑制作用（图 6A）。相反，其母体多酚苷 phloridzin 和 polydatin 本身对 C. difficile 并不具备抗菌活性（图 6A）。

图6 | 由拟杆菌属对多酚苷的生物活化生成抗生素

(A) 多酚苷及其苷元对一组肠道病原菌生长影响的热图。生长通过在添加葡萄糖和 150 μM 多酚苷或苷元的培养基中测得的生长面积（AUC）与在添加葡萄糖和载体的培养基中测得的生长面积（AUC）之比表示。值 > 1 表示该化合物促进生长，值

(B) 在添加多酚苷 polydatin 或由拟杆菌释放的苷元白藜芦醇（resveratrol）条件下，20 株艰难梭菌（Clostridioides difficile）菌株的生长热图。生长促进或抑制通过在添加葡萄糖和 150 μM polydatin 或白藜芦醇的培养基中测得的生长面积（AUC）与在添加葡萄糖和载体的培养基中测得的生长面积（AUC）之比表示。值 > 1 表示该化合物促进生长，值

(C) 小鼠感染艰难梭菌 630 后第 2 天，分别给予载体、500 μM 白藜芦醇或 根皮素酚(phloretin)的饮用水处理组中，艰难梭菌的菌落形成单位（CFU）数量。

在 (A) 中，dG 表示二葡萄糖苷。高通量筛选实验数据来自一次生物重复，每个样本三次技术重复。在 (B) 中，数据来自一到两次生物重复，每个样本三次技术重复。在 (C) 中，数据来自两次独立实验的汇总（每个实验中 n = 3–5 只小鼠）。(C) 中误差线表示均值 ± 标准误（SEM）。统计显著性表示如下：非显著 p > 0.05，∗p

B. uniformis 在与白藜芦醇苷共培养时可释放出白藜芦醇（图 5C），并产生显著的抗艰难梭菌（C. difficile）活性（图 S4A）。然而，这两种功能在 B. uniformis ΔgshD（缺失了糖苷特异性 GH3 酶 Bu gshD 的突变株）中均被消除（图 S4B 和 S4C），表明白藜芦醇苷的生物活化及白藜芦醇的释放依赖于 GH3 酶 Bu gshD。艰难梭菌感染（CDI）是导致死亡和发病率上升的重要因素，通常与抗生素使用后肠道微生物组的定殖抗性缺失有关。我们在 20 株具有产毒能力和高毒力特征的不同 C. difficile 菌株中发现，由 B. uniformis 释放的多酚类苷元白藜芦醇，而非其前体糖苷白藜芦醇苷，普遍具有抗 C. difficile 的活性（图 6B）。在小鼠 CDI 模型中，B. uniformis 产生的苷元白藜芦醇和根皮素酚(phloretin)在体内展现出强效的抗 C. difficile 活性（图 6C），这一作用发生在抗生素处理后肠道微生物组恢复的背景下（图 S4D 和 S4E）。此外，我们未发现白藜芦醇被降解（图 S4F），也未观察到其在小鼠肠道中被代谢为二氢白藜芦醇（图 S4G），尽管在人类肠道中某些微生物可以将其还原为该代谢产物。值得注意的是，二氢白藜芦醇仍保留抗 C. difficile 活性（图 S4H）。综上，我们的研究揭示了多酚类苷元对白藜芦醇具有抗人类肠道病原菌 C. difficile 的新功能，并强调了肠道微生物组中成员对膳食植物糖苷的生物活化在介导一种新型定殖抗性机制中的作用，这种机制依赖于特定植物化合物的微生物激活。

拟杆菌属对不同酚类糖苷的功能化调节肠道免疫稳态

植物糖苷在植物中具有多种功能，参与从稳态调节到应激反应等多个过程，已有研究提出它们在人类健康中可能发挥有益或致病作用，尤其涉及炎症和癌症方面。然而，肠道微生物群是否以及如何介导植物糖苷对宿主的这些影响仍知之甚少。考虑到拟杆菌属（Bacteroides），尤其是B. uniformis，在人体肠道中的丰富性，以及我们已经确认该菌能通过释放多种脱糖苷化物（苷元s）功能化植物糖苷，我们进一步探究了B. uniformis对植物专属代谢物（PSM）糖苷的生物转化是否在炎症中发挥作用。为此，我们评估了芳香族糖苷和多酚类糖苷及其由B. uniformis释放的相应脱糖苷化物是否能调节脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞产生肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-6（IL-6）。结果发现，芳香族糖苷水杨苷（salicin）、红景天苷（salidroside）及多酚类糖苷芦丁（rutin）和橙皮苷（naringin）本身均不影响细胞因子产生；但其由B. uniformis释放的对应脱糖苷化物——水杨醇（saligenin）、酪醇（tyrosol）、槲皮素（quercetin）和柚皮素（naringenin）——则在TNF 和 IL-6 上均表现出广泛的抗炎作用。芳香族糖苷熊果苷（arbutin）选择性地抑制TNF，但不影响IL-6；其脱糖苷化产物对羟基苯酚（hydroquinone）则对巨噬细胞具有细胞毒性。多酚类糖苷白藜芦醇苷（polydatin）增强IL-6（但不影响TNF）产生，而当其被脱糖苷化为白藜芦醇（resveratrol）后，该促炎效应转变为显著的抗炎作用。芳香族糖苷天麻苷（gastrodin）本身不影响细胞因子表达，但其脱糖苷化物天麻素（gastrodigenin）却在巨噬细胞中呈现出相反效应：抑制TNF，同时增强IL-6。此外，多酚类糖苷橙皮苷和天麻苷对细胞因子无影响，但其脱糖苷化产物分别表现出不同的调节效应：柚皮素抑制IL-6、增强TNF；天麻素则增强IL-6、抑制TNF。多酚类糖苷苹果苷（phloridzin）本身对巨噬细胞无效，但其脱糖苷化产物苹果素（phloretin）虽然不影响TNF，却能抑制IL-6。总的来说，我们的研究揭示了B. uniformis通过生物转化不同植物糖苷，生成一系列在炎症功能上具有显著多样性的脱糖苷化物。

图7 | 拟杆菌属对不同膳食酚类糖苷的功能化介导肠道免疫稳态

(A) 经不朽化的小鼠骨髓来源的巨噬细胞（iBMDMs）在LPS（1 μg/mL；大肠杆菌O111:B4）刺激后24小时内，分别在有无特定芳香糖苷（总共40小时；16小时的LPS前处理孵育和24小时的LPS刺激）及其相应的苷元的情况下，分泌TNF（左）和IL-6（右）。橙色表示与单独LPS相比，细胞因子生产显著诱导，蓝色表示与单独LPS相比，细胞因子生产显著抑制。 (B) 芳香糖苷及其相应的苷元对TNF（左）和IL-6（右）细胞因子生产的诱导或抑制。橙色表示与单独LPS相比，细胞因子生产显著诱导，蓝色表示与单独LPS相比，细胞因子生产显著抑制。 (C) 各时间点内，移植了B. uniformis WT或B. uniformis ΔgshDΔgshGΔgghC的无菌小鼠粪便中saligenin浓度，在胃内灌注salicin（100 mg/kg体重）后。 (D) 体重和结肠长度：PBS或DSS（2.5%）处理的小鼠，移植了B. uniformis WT或B. uniformis ΔgshDΔgshGΔgghC，并每天胃内灌注salicin（100 mg/kg体重）或PBS对照。 (E) 体重和结肠长度：PBS或DSS（2.5%）处理的小鼠，移植了B. uniformis WT，并每天胃内灌注salicin（100 mg/kg体重）、arbutin（100 mg/kg体重）或PBS对照。 (F) 白细胞浸润的组织病理评分。对于图5D和5E中描述的实验。 (G) 图5D和5E中描述的实验的代表性H&E图像。

在(B)中，dG是二葡萄糖苷。在(A)和(B)中，数据代表两次生物学重复，每次都有技术性三重复。在(C)中，数据来自一个独立实验（每个实验n = 4只小鼠）。在(D)–(F)中，数据结合了两到三次独立实验（每个实验n = 3–5只小鼠）。在(D)和(E)中，结肠长度在第8天测量。在(A)和(B)中，误差条表示平均值±标准差（SD）。在(C)–(F)中，误差条表示平均值±标准误差（SEM）。非显著性p > 0.05，∗p

B. uniformis对PSM糖苷（如水杨苷、沙地罗苷、槲皮苷和柚皮苷）的生物激活作用，表明这些膳食和药用植物糖苷的抗炎作用可能通过肠道微生物群代谢并释放其相应的生物活性配基元来介导。例如，芳香糖苷水杨苷长期以来被认为在健康和疾病中具有广泛的镇痛和抗炎作用，并且是水杨酸和阿司匹林（乙酰水杨酸）开发的基础。我们发现，水杨苷代谢产物——生物配基元水杨醇，在LPS刺激的巨噬细胞中显著抑制TNF和IL-6的产生（图7A和图S5B）。生物配基元水杨醇的释放依赖于B. uniformis的糖苷代谢系统，因为在B. uniformis缺乏所有三个糖苷水解酶（GHΔΔΔ；ΔgshDΔgshGΔgghC）突变体中，水杨苷转化为水杨醇的过程在体外是不存在的，而在野生型B. uniformis（WT）中存在（图S6A）。将无菌小鼠与B. uniformis WT或B. uniformis GHΔΔΔ定植后，口服给药水杨苷，显示出B. uniformis依赖的saligenin释放（在粪便中检测到）以及对B. uniformis糖苷代谢系统的依赖（图7C）。

作者简介

美国马萨诸塞州波士顿市波士顿儿童医院Gavin A. Kuziel和Gabriel L. Lozano为本文的第一作者，Seth Rakoff-Nahoum为本文的通讯作者。

Seth Rakoff-Nahoum （通讯作者）

Seth Rakoff-Nahoum 是哈佛医学院微生物学系副教授及波士顿儿童医院的儿科医生和研究人员，专注于研究肠道共生微生物与宿主之间的相互作用机制。他的研究结合免疫学、微生物学和进化生物学，探讨微生物如何调节宿主免疫反应、维持肠道稳态，并在宿主体内适应和演化。他的工作揭示了共生菌通过信号传导和代谢活动影响宿主健康的机制，对理解炎症性疾病及开发微生物治疗策略具有重要意义。

翻译：荀佳妮，中国农科院基因组所，生物信息学硕士在读

审核：朱志豪，广东医科大学，基因组所联合博士后

终审：刘永鑫，中国农科院基因组所，研究员/博导

排版：杨海飞，青岛农业大学，基因组所联培硕士在读

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