摘要：在蛋白质合成的世界中，天然氨基酸的 20 种“字母”早已无法满足科学家书写生命新篇章的需求。通过遗传密码重编程技术，研究者试图将多种非天然氨基酸（npAAs）插入多肽链，赋予蛋白质催化、靶向甚至抗降解等能力。然而，这一愿景长期受限于一个关键步骤：如何高效地将
在蛋白质合成的世界中，天然氨基酸的 20 种“字母”早已无法满足科学家书写生命新篇章的需求。通过遗传密码重编程技术，研究者试图将多种非天然氨基酸（npAAs）插入多肽链，赋予蛋白质催化、靶向甚至抗降解等能力。然而，这一愿景长期受限于一个关键步骤：如何高效地将 npAAs“安装”到转运 RNA 上。传统方法依赖柔性酶 Flexizyme 和苄基酯（BZEs）系统，但面对环状 β-氨基酸或 N-乙酰化脯氨酸等“顽固分子”时，氨酰化效率常常跌破 20% 的实用阈值，甚至完全失败。
东京大学的研究团队近期在 Nature Communications 发表的成果“A super versatile flexizyme system with phenol esters for genetic code reprogramming”，彻底打开了这一僵局。团队开发的苯酚酯-柔性酶（eFx）系统，不仅提高了氨酰化效率，更首次实现了复杂大环肽的精准合成，为合成生物学和药物开发开辟了新大陆。
传统 Flexizyme 技术的瓶颈，本质在于其依赖的苄基酯类化合物（BZEs）化学特性。这些分子中的苯环虽能被 Flexizyme 识别，但在温和反应条件下活性不足。东京大学团队敏锐地意识到，解决问题的核心在于重新设计酰基供体的离去基团。他们找到了苯酚酯——这类分子中的酚羟基 pKa 值可通过取代基灵活调节，既能避免过度反应，又能与 tRNA 的 3'-羟基特异性结合。团队预测了五种苯酚酯的 pKa 值，最终锁定 3-硝基苯酚酯（3NP）。其 pKa 为 8.5，恰好处在“黄金区间”：酸性足以在生理条件下释放酚羟基，又不至于活跃到攻击 tRNA 的其他位点。更巧妙的是，3NP 的硝基取代基与 Flexizyme 活性中心的芳香族结构形成 π-π 堆积作用，如同磁铁般将分子精准锚定。
然而，仅靠苯酚酯的化学优化并不足以颠覆传统体系。真正的突破来自团队对 Flexizyme 催化剂的重编程。他们发现，经过定向进化优化的 eFx 版本，竟对 3NP 酯展现出惊人的兼容性。当传统 BZEs 系统对 Ac-L-Pro 束手无策时，eFx 与 3NP 的组合却让这一“顽固分子”的 tRNA 负载率从零跃升至 41%。对于环状 β-氨基酸（1S,2S）-2-ACHC，eFx 仅需 30 分钟即可实现 90% 左右的氨酰化产率，较传统 dFx 催化剂（需 16 小时、pH 9.0）提升近 6 倍。这种“分子加速器”的机制，可能源于 eFx 活性口袋的柔性调整：其 RNA 骨架的特定碱基与 3NP 酯的硝基形成氢键网络，同时通过空间位阻效应排除非目标反应，将化学能精准导向 3'-羟基。
图 | eFx 与传统催化剂的效率差异
效率的跃升直接催生了合成能力的质变。研究团队设计了一系列从简单的线性重复到包含六种 npAAs 的复杂大环结构，全面检验系统的可靠性。在第一个实验中，他们通过工程化 tRNAPro1E2 连续插入五个（1S,2S）-2-ACPC 单元——这种环状 β-氨基酸因刚性结构常导致翻译中断。令人惊叹的是，最终产物质谱显示单一主峰，证明每个位点的氨酰化效率均超过阈值。而在大环肽 P14 的合成中，该分子不仅包含四氢异喹啉酸（Tic）和 α-氨基异丁酸（Aib）等非经典结构，还整合了 D-型氨基酸、N-甲基化苯丙氨酸以及氯乙酰化脯氨酸，形成直径约 1.2 纳米的刚性环状骨架。质谱数据中，[M+H]+峰与理论值完全吻合，仅在 ACU 密码子处检测到微弱的半胱氨酸误掺信号——这种“几乎完美”的结果，连团队负责人也坦言“远超预期”。
图 | 含 6 种非天然氨基酸的大环肽 P14 合成验证
这些合成突破的背后，是一套精密的分子工程策略。以 tRNAPro1E2 为例，其 D 臂和 T 臂经过重新设计，能够招募延伸因子 EF-P 至核糖体 E 位，防止肽酰-tRNA 在翻译过程中意外脱落。这种“分子安全带”显著提升了长链肽的合成效率，使得连续插入五个 npAAs 仍能保持 95% 以上的完整率。而对于大环肽 P14，氯乙酰化脯氨酸的引入成为闭环反应的关键：其 N 端的氯乙酰基与下游半胱氨酸侧链自发形成硫醚键，在翻译完成后“自动扣合”成环。这种将化学修饰与核糖体合成无缝衔接的策略，为人工设计多功能大环分子提供了全新范式。
站在应用视角，这项研究的价值早已超越基础工具优化。通过 RaPID 展示技术，科学家可从数万亿个 npAAs 肽库中筛选出高亲和力靶向分子，为癌症、感染性疾病提供全新治疗方案。例如，乙酰化脯氨酸的引入能显著抵抗蛋白酶降解，有望延长多肽药物的体内半衰期；而大环结构赋予的刚性则能精确锁定靶蛋白的“隐秘口袋”，解决传统小分子难以触及的蛋白-蛋白相互作用界面。更令人期待的是，团队已着手通过定向进化改造 eFx，计划将其催化范围扩展至含氟酚酯甚至更奇特的离去基团。
参考链接：
1.Choi, YK., Katoh, T., Beattie, A. et al. A super versatile flexizyme system with phenol esters for genetic code reprogramming. Nat Commun 16, 4671 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-59921-w
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来源：生辉SciPhi