摘要：组成我们身体的血液细胞，它们各自有着怎样的“家族史”和“奋斗历程”？从胚胎时期仅有的几个祖细胞开始，它们如何一代代繁衍、分化，最终构建起支撑我们生命的庞大血细胞网络？追踪细胞的“出身”（即细胞谱系追踪）是揭开发育、衰老和疾病奥秘的关键。然而，现有技术就像是尝试

组成我们身体的血液细胞，它们各自有着怎样的“家族史”和“奋斗历程”？从胚胎时期仅有的几个祖细胞开始，它们如何一代代繁衍、分化，最终构建起支撑我们生命的庞大血细胞网络？追踪细胞的“出身”（即细胞谱系追踪）是揭开发育、衰老和疾病奥秘的关键。然而，现有技术就像是尝试在茫茫人海中，仅凭稀疏的胎记或需要特殊标记的服装来追踪个体，难度巨大，难以大规模应用到像人体自然衰老这样复杂的进程中。

5月21日发表在《Nature》上的突破性研究“Clonal tracing with somatic epimutations reveals dynamics of blood ageing”，为我们带来了一把全新的钥匙！研究人员发现，在我们的DNA上，隐藏着一种独特的“静态指纹”——特定CpG位点上随机产生的、却能稳定遗传给子代细胞的DNA甲基化模式。这些“表观突变”就像细胞在生命早期获得的数字条形码，不随细胞分化改变，却能准确记录细胞的克隆身份。

基于这一惊人发现，研究人员开发出一种革命性的新工具——EPI-Clone。这项技术无需对细胞进行基因改造，就能高精度地在单细胞层面，同时读取这些克隆“指纹”和细胞的分化状态。它能以前所未有的精度，绘制出细胞群体的“族谱”和“生活地图”！这项研究利用EPI-Clone，深入解析了小鼠和人类血液在衰老过程中的克隆动力学，揭示了令人意想不到的衰老克隆扩张图景。这项创新技术和随之而来的重要发现，无疑将为我们理解生命进程和攻克衰老相关疾病，打开新的大门！

基因组里的“静态指纹”：细胞的秘密身份

DNA，它不仅仅携带遗传密码，还在上面留下了像“便利贴”一样的化学标记——DNA甲基化，通常发生在CpG位点（CpG Site）。这些标记并非一成不变，它们会随着细胞的分化而发生规律性变化（Dynamic CpGs），帮助细胞决定自己的身份和功能。但该研究发现，还有一部分CpG位点上的甲基化标记，它们的变化更像是随机发生的“表观突变”（Epimutations），一旦发生，就能稳定地遗传给子代细胞，并且不随着分化状态而改变！研究人员将这些具有“记忆”功能的位点称为静态CpG（Static CpGs）。

静态CpG就像是细胞在生命早期随机获得的独特“胎记”或“指纹”。随着细胞不断分裂，这些静态CpG上的甲基化模式被精确复制并传递，于是来自同一个祖先细胞（即同一个克隆, Clone）的所有子细胞，无论它们最终分化成了哪种成熟血细胞，都共享一套相似的静态CpG甲基化模式。这就是细胞的“秘密身份”，一种内源性的、稳定遗传的数字条形码！

研究人员通过小鼠实验证实了这一发现。他们分析了小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC, Hematopoietic Stem and Progenitor Cells）中453个CpG位点的甲基化数据。结果显示，其中一部分CpG位点（动态CpG）的甲基化状态与细胞的分化阶段紧密相关，能够区分不同的细胞亚群，比如造血干细胞、多能祖细胞（MPP, Multipotent Progenitor）和髓系祖细胞（Myeloid Progenitor）等。而另一部分CpG位点（静态CpG）的甲基化状态则与细胞的分化状态无关，却能很好地反映细胞的克隆来源（通过基因条形码验证）。有趣的是，静态CpG更多地富集在基因组的异染色质区域（Heterochromatic Regions）和晚期复制区域（Late-replicating Domains），这或许暗示了这些区域更容易在细胞快速增殖或表观基因组重塑时产生随机的甲基化变化。

EPI-Clone：为细胞谱系追踪插上翅膀

为了读取并利用这些静态CpG携带的克隆信息，研究团队开发了一种名为EPI-Clone的新方法。这项技术基于单细胞靶向DNA甲基化分析平台（scTAM-seq），能够同时获取单个细胞中数百个目标CpG位点上的甲基化状态，以及细胞表面的蛋白表达信息。最重要的是，整个过程无需对细胞进行基因改造（Transgene-free）。

EPI-Clone算法主要分三步：

识别静态CpG：找到那些甲基化状态与细胞分化状态无关的CpG位点。

识别扩增克隆（Expanded Clones）：在静态CpG定义的甲基化空间中，通过计算细胞密度，找到那些聚集在一起、细胞数量较多的克隆群体。高密度的区域通常对应于那些经历过显著增殖扩增的克隆。

对扩增克隆进行聚类：将识别出的扩增克隆细胞进行更精细的聚类，划分出不同的克隆单元。

研究人员用带有已知基因条形码的小鼠造血细胞验证了EPI-Clone的准确性。他们将标记好的造血干细胞移植到小鼠体内，5个月后分析其血液细胞。EPI-Clone成功地利用静态CpG信息重建了克隆关系，对于相对大小超过0.25%的扩增克隆，识别细胞的准确率达到了AUC 0.79，克隆聚类的调整兰德指数（ARI, Adjusted Rand Index）高达0.88。即使是在一个独立的重复实验中，结果也高度一致（AUC 0.68，ARI 0.82），这证明了静态CpG携带的克隆信息在体内能够稳定存在数月。EPI-Clone不仅能追踪造血干细胞和祖细胞，还能追踪成熟的免疫细胞（Immune Cells），对单核细胞（Monocytes）和中性粒细胞（Neutrophils）等细胞亚群，EPI-Clone识别的克隆与基因条形码的ARI值高于0.7。这说明，静态CpG的表观遗传指纹在大多数细胞谱系中都能维持到终末分化。更进一步，该方法也被成功应用于小鼠肺部的内皮细胞（Endothelial Cells），证明了其广泛适用性。

小鼠模型的克隆衰老：谁是血液大军的“老兵油子”？

EPI-Clone强大的功能使得研究人员能够以前所未有的视角，观察自然衰老过程中小鼠造血系统的克隆动力学。他们比较了年轻小鼠（12周龄）和老龄小鼠（100周龄）骨髓中的造血细胞。

研究发现，年轻小鼠的造血系统已经是“多克隆”（Polyclonal）的，大约50%的细胞来自于少量较大的克隆（相对大小约占总造血干细胞祖细胞的1-4%），其余细胞则属于大量微小的克隆。而在老龄小鼠体内，扩增克隆的数量更多，单个克隆的大小也显著更大（Wilcoxon检验P=0.012），这反映了随着年龄增长，部分克隆经历了更强的选择性扩增，导致克隆多样性（Clonal Diversity）下降。

更有趣的是，EPI-Clone揭示了这些扩增克隆的功能差异。在老龄小鼠中，研究人员发现了一些主要由造血干细胞（HSC）组成的扩增克隆（HSC-expanded clones）。这些克隆细胞数量多，但产生的后代细胞却非常少，似乎在分化能力上存在缺陷。通过移植实验进一步证实，这些老龄小鼠体内扩增的HSC克隆的植入能力（Engraftment Capacity）很差，在重建血液系统中的贡献很小。反而，移植后血液系统的主要贡献者是那些在移植前属于非扩增的HSC。

老龄小鼠整体表现出髓系偏向（Myeloid Bias）的增加，而这种髓系偏向在那些罕见的、细胞数量多但后代少的HSC扩增克隆中尤其显著（Wilcoxon检验P=0.01，另一个重复P=0.076）。这与传统的移植研究结论有所不同。这些数据表明，老龄小鼠造血干细胞数量的增加和产出效率的降低，主要源于少数扩增但功能受限的克隆。那些未经历显著扩增、保持“年轻”状态的HSC克隆，似乎在老龄时仍然维持功能并驱动着再造血。

人类克隆图景：CH突变只是衰老扩增谱系的一部分？

将EPI-Clone方法应用于人类骨髓样本，研究人员构建了靶向人类造血祖细胞CpG位点的基因组区域面板（包含448个CpG位点）。他们分析了来自不同年龄的14位捐献者（年龄范围23-77岁）共135,432个单细胞。这些捐献者中有部分之前已检测出克隆性造血（CH, Clonal Hematopoiesis）相关的驱动突变，研究人员也通过scTAM-seq数据额外识别出了10个CH驱动突变和1个Y染色体丢失（LoY）事件，这些已知突变和LoY事件也作为EPI-Clone的验证“金标准”。

研究发现，EPI-Clone成功地根据静态CpG甲基化模式识别出了带有已知CH突变的克隆（CH Clones），这些CH克隆在静态CpG的UMAP图上聚集在一起。除了CH克隆，EPI-Clone还在7位骨髓捐献者中额外识别出了67个其他扩增克隆，这证明了该方法能够捕获未知驱动因素引起的克隆扩增。EPI-Clone识别的克隆身份在成熟的NK细胞（NK Cells）和不成熟的B细胞（Immature B Cells）中也能得到验证，而在T细胞（T Cells）和成熟B细胞（Mature B Cells）中，识别的克隆更偏向于淋巴系（Lymphoid）起源的聚类，这与小鼠结果一致。

年龄与克隆扩增的关系在人类样本中尤为明显。在总骨髓（TBM, Total Bone Marrow）队列中，研究观察到CH克隆和非CH克隆（没有已知驱动突变的扩增克隆）都随着年龄增长而累积。在CD34+细胞队列中，尤其是在50-60岁的捐献者中，样本中粒单核祖细胞（GMP, Granulocyte-Macrophage Progenitors）的比例与扩增克隆的累积呈正相关，这可能提示促进髓系生成的信号通路也与克隆扩增有关。

CH克隆倾向于比非CH克隆更大，但并非总是最大。研究还发现，无论是CH克隆还是非CH克隆，扩增的克隆都显著地在B细胞和红系（Erythroid）谱系中减少，而在HSC和MPP中富集。这种在干细胞和早期祖细胞中的偏向在小鼠和人类中都是保守的。这些结果支持了一种模型，即CH克隆是年龄相关扩增克隆谱系的一部分，它们表现出相似的功能特性和谱系偏向。

研究人员还探究了同一个细胞中，DNA甲基化与转录组（Transcriptome）信息（通过scTAMARA-seq技术）或线粒体突变信息（通过scTAMito-seq技术）的关系。他们发现，EPI-Clone识别的克隆命运偏向确实与早期干细胞和祖细胞状态下的基因表达变化相关联，例如，HSC/MPP偏向的克隆在HSC/MPP水平表达较低的TAL1和SLC40A1基因，而CEBPA基因表达较高。与现有线粒体突变追踪方法相比，EPI-Clone识别的克隆与大部分线粒体突变没有明确的谱系关系，这进一步强调了线粒体遗传学的复杂性，以及在不同分化阶段可能发生的变异选择，侧面突出了EPI-Clone基于表观突变的独立价值。

血液之外的广阔天地：EPI-Clone的未来

这项研究成功开发了EPI-Clone，一种利用静态CpG作为内源性数字条形码，实现高精度、无转基因、单细胞谱系追踪的新方法。它能够同时获取细胞的分化状态和克隆身份信息。静态CpG的表观突变作为稳定的、长期的谱系标记，在血液发育的快速增殖和DNA甲基化重塑阶段（如HSC规范化）随机产生，并稳定遗传，这为理解克隆起源提供了新的视角。

EPI-Clone的强大之处在于其稳健性和可扩展性。相比于全基因组测序等方法，它更具成本效益和高通量优势，能够分析数十万甚至更多单细胞。虽然需要针对不同物种设计靶向面板，但一旦建立，就能重复使用。

通过EPI-Clone，我们清晰地看到，无论是小鼠还是人类，造血系统都会随着年龄从高度多克隆状态向寡克隆（Oligoclonal）状态转变。小鼠的扩增克隆数量多但个体小，对移植贡献低。人类的寡克隆生成大约在50岁左右变得可检测，并在60岁后表现出类似“时钟”般的进程。最重要的是，研究将CH突变引起的克隆扩增置于更广泛的年龄相关克隆扩增谱系中。CH克隆确实更偏向髓系和干细胞扩增，但它们与没有已知驱动因素的扩增克隆一起，构成了具有相似功能特性的年龄相关扩增谱系的一部分。这改变了以往过分关注特定CH驱动突变的视角，提示我们应该更全面地研究年龄导致的克隆性衰退。

未来，EPI-Clone有望应用于更广泛的细胞类型和组织，深入探索发育、衰老和疾病中各种细胞的谱系动态。它为我们提供了一个前所未有的工具箱，去解码细胞的命运、理解组织稳态的维持以及疾病的发生发展。

这项研究不仅是单细胞技术和表观遗传学领域的重大进展，也为衰老生物学和克隆性疾病研究开辟了新方向。EPI-Clone的问世，让我们离绘制细胞命运的完整图谱更近了一步！

参考文献

Scherer, M., Singh, I., Braun, M.M. et al. Clonal tracing with somatic epimutations reveals dynamics of blood ageing. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09041-8

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来源：生物探索一点号1