干货 | 蛋白-DNA互作实验手册（文末有视频教程）

摘要：蛋白质与DNA互作广泛存在于生物体内的各种生命活动中，是协调生命活动的基础，主要包括基因的复制、转录、翻译、修饰等过程。研究蛋白质-DNA相互作用，对于我们了解DNA转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有重要的指导作用。为了研究两者的互作关系，科学家

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蛋白-DNA互作实验手册

蛋白质与DNA互作广泛存在于生物体内的各种生命活动中，是协调生命活动的基础，主要包括基因的复制、转录、翻译、修饰等过程。研究蛋白质-DNA相互作用，对于我们了解DNA转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有重要的指导作用。为了研究两者的互作关系，科学家发明了很多方法：酵母单杂交、双荧光素酶报告基因检测、凝胶迁移实验EMSA等。

酵母单杂交

一、 酵母单杂交

酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术GAL4系统发展而来的，是一种在酵母细胞内分析与鉴定转录因子与DNA顺式作用元件相互结合的有效方法。该技术被广泛应用于植物功能基因组学的研究。

1.1 酵母单杂交原理

酵母单杂交技术基于酵母细胞中报告基因的激活，将特定顺式作用元件（Bait DNA）构建到含报告基因的酵母表达载体上, 将编码转录因子的CDS（Prey蛋白）构建到另一个含激活结构域的酵母表达载体上，将上述两种融合表达载体共转化至酵母细胞中, 此时转录因子若能结合在顺式作用元件上, 则会启动下游报告基因的表达。

图酵母单杂交的基本原理示意图

1.2 酵母单杂交的应用

（1）转录因子研究：酵母单杂交可用于研究转录因子与DNA序列的特异性结合。通过构建诱饵包含启动子或增强子序列，并与猎物中的转录因子相互作用，可以鉴定和验证转录因子-基因调控序列的相互作用关系。

（2）DNA结合蛋白鉴定：酵母单杂交可用于鉴定与特定DNA序列相互作用的蛋白质。通过构建诱饵包含DNA结合序列，与猎物中的蛋白质相互作用，可以筛选和验证与该DNA序列特异性结合的蛋白质。

（3）蛋白质相互作用网络：通过酵母单杂交技术可以筛选和鉴定DNA与蛋白质间的相互作用关系，从而构建蛋白质相互作用网络。这有助于了解细胞内蛋白质相互作用的调控机制、信号传导途径和细胞过程的调节。

1.3 酵母单杂交系统类型

酵母单杂互作验证实验常用系统有Y1HGold-pAbAi、Y187-pHis2和EGY48-pLacZ-2μ。

（1）pAbAi-Bait (DNA)+pGADT7rec2或者pGADT7；Y1HGold菌株。插入目的DNA的pAbAi载体需要线性化后转到Y1HGold菌株，制成Bait菌株；筛选标记AbA。

（2）pHis2-Bait（DNA）+pGADT7；Y187菌株。Bait不需要整合到酵母基因组，不需要线性化；筛选标记His+3-AT。

（3）pLacZi-2μ -Bait（DNA）+pB42AD；EGY48菌株。Bait载体不需要线性化整合到酵母基因组；筛选标记X-gal。

1.4 酵母单杂交系统优缺点

1.4.1 酵母单杂交系统优点

（1）真实性：DNA-蛋白互作发生真核细胞酵母体内，植物蛋白能维持更为天然的结构及修饰，互作结果更可信。

（2）灵敏性：利用高表达启动子和多拷贝诱饵，可以用于检测微弱或短暂蛋白-DNA的互作。

（3）高通量：利用酵母文库构建，单次反应可以完成数万蛋白与DNA的互作检测。

（4）高精度：可以通过诱饵截短或突变获得蛋白最精确的结合序列。

（5）操作简单：不依赖于蛋白表达和纯化就可以实现检测。

（6）结果直观：通过简单的观察菌落生长状态就可以判断是否互作。

1.4.2 酵母单杂交系统缺点

（1）自激活：由于诱饵序列上可能大量存在与酵母中自身蛋白结合序列，会造成较为剧烈的自激活。

（2）假阳性：酵母中或文库中具有激活能力的蛋白直接结合到诱饵序列上。

（3）假阴性：部分真核蛋白可能对酵母产生毒性，会导致酵母生长缓慢；蛋白不能在酵母中稳定表达或表达后不正确折叠会导致蛋白有效结合诱饵产生假阴性。

1.5 酵母单杂交实验流程

（1）构建诱饵酵母菌株：将诱饵基因构建到含报告基因的酵母表达载体，转化至酵母细胞。

（2）构建表达文库：从目标组织或细胞中提取mRNA，反转录成cDNA并连接至含激活结构域的酵母表达载体中（通常使用包含GAL4激活结构域的载体）。

（3）cDNA文库转化至诱饵酵母细胞：鉴定正确的诱饵酵母制备成感受态细胞，将cDNA表达文库载体转化至酵母细胞中。

（4）阳性克隆菌株的筛选：在含选择标记的培养基上培养转化后的酵母细胞。当转录因子与诱饵基因结合并激活报告基因时，酵母细胞在选择培养基上生长。通过PCR扩增、测序、比对等方法鉴定阳性克隆。

（5）互作克隆验证：将筛选出的阳性克隆重新转化含诱饵序列的酵母中，确认相互作用的特异性和重复性；或者使用凝胶阻滞迁移率实验在体外验证相互作用。

Coolaber的酵母单杂试剂盒，提供了实验所需的所有试剂和完整的实验方案，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。

产品特点：

本公司根据多年经验，结合本公司的单杂培养基套装、感受态制备和酵母基因组菌落PCR等试剂盒，对实验的操作流程进行了优化，减少了操作步骤，提供了详细且完整的实验方案，为进行酵母单杂实验提供了有利条件。

1.6 常见问题解析

（1）诱饵DNA有什么要求？

答：诱饵DNA一般会选择顺式作用元件或者启动子序列。顺式作用元件作为诱饵时尽量使用短的顺式作用元件（一般＜20 bp），串联重复2-3次作为诱饵DNA；如果顺式作用元件超过100 bp，使用1个拷贝即可。启动子序列作为诱饵时不要包含TATA box。如果启动子序列小于100 bp，使用2个拷贝作为诱饵。如果超过100 bp，使用1个拷贝作为诱饵。

（2）诱饵存在自激活怎么办？

答：pAbAi-bait存在自激活，需要设置梯度浓度AbA的SD/-Ura平板培养；pHis2-bait存在自激活，需要设置梯度浓度3-AT（SL0930）的SD/-His/-Trp平板培养，进一步检测自激活的强度。

（3）如果出现自激活无法抑制情况怎么办？

答：

a、首先核对菌落涂布浓度。涂板或者点板的菌浓度是影响自激活抑制的主要原因，同一浓度的AbA或者3-AT对于不同数量菌的抑制效果不同。

b、核对自激活体系是否正确。建议选用pAbAi-P53做对照，已知pAbAi-P53存在自激活，而且100-200 ng/mL的AbA可以抑制其自激活现象。如不能抑制，则说明筛选培养基配制错误。

c、当AbA浓度达到1000 ng/mL，或3-AT浓度达到80 mM，诱饵自激活还是无法抑制，那说明插入的Bait自激活过强，无法进行筛库以及验证实验。需要重新构建Bait。

（4）如何排除或降低假阳性？

a、对于点对点验证来说，可同时将诱饵和猎物进行自激活验证，减少假阳性的判定；

b、不同报告基因上游的调控区不同，可用不同的报告基因验证阳性，用于排除或减少假阳性；

c、质粒拷贝数变化可能引起的基因表达水平的波动，因而造成假阳性，可将报告基因整合到酵母的染色体上，使基因表达水平稳定。

附单杂推文合集：

《酵母单杂完整解决方案：实验室精英版》

双荧光素酶报告实验

二、双荧光素酶报告基因检测系统

双荧光素酶报告基因检测系统（Dual-Luciferase Reporter Assay）是以荧光素（Luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统，包括萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶两部分。

萤火虫荧光素酶是一种61 kDa的单体蛋白，不需要翻译后加工就能产生酶活性，因此，它在翻译后立即发挥报告基因的作用。只有荧光素、氧气、ATP和Mg2+同时存在时，萤火虫荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出波长为560 nm左右的生物荧光(bioluminescence)。

海肾荧光素酶是一种36 kDa的单体蛋白，从其天然来源海肾中纯化。海肾荧光素酶的底物和辅因子要求不同，反应过程无需ATP和镁离子参与。海肾荧光素酶催化的发光反应利用氧气和腔肠素（coelenterazine），发光颜色为蓝光，波长480 nm。

2.1 双荧光素酶报告基因检测系统原理

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，经适当处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断处理前后调控元件的影响。

一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，相当于做了标准化，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

2.2 双荧光素酶报告基因检测系统的应用

（1）验证microRNA同mRNA靶向互作。

将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

（2）验证特定转录因子同其调控序列的作用。

在一个研究中，要验证特定转录因子对某基因启动子活性的影响。构建一个含有该基因启动子的荧光素酶报告质粒，并将它转化入细胞中。当转录因子被激活并结合到启动子上时，会驱动荧光素酶基因的表达。检测到的荧光素酶活性增强表明转录因子成功上调了基因的表达。

（3）验证microRNA同lncRNA靶向互作

将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中FLUC 3’UTR区域，检测荧光素酶活性。

（4）启动子结构分析

将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入荧光素酶报告载体，检测其启动子活性。

（5）启动子SNP分析

一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。

（6）转录因子转录活性分析

将待测转录因子与GAL4结合域构建在同一载体上，与含有GAL-TATA4 转录调控元件并带有萤光虫荧光素酶报告基因的载体共转，使这段序列调控荧光素酶基因的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，培养后裂解细胞，并加入底物荧光素，荧光素酶可催化荧光素发出荧光。通过检测荧光值的高低可以判断转录因子是否具有转录激活或者转录抑制作用。

2.3 双荧光素酶报告基因检测系统类型

（1）两种荧光素酶分别位于两个载体上：

在利用植物原生质体细胞为载体的双荧光素酶报告基因检测研究中，经常使用多个载体进行检测蛋白的转录活性以及对下游靶标的调控。如GAL4DB、5× TATA-GAL4、190-Luc、Rluc。

（2）两种荧光素酶位于同一载体上：

考虑到实验偏差、细胞转染难易程度、细胞承受力等问题，研究人员又进一步对双荧光素酶报告系统的载体进行优化，将两种荧光素酶基因引入同一个载体，以实现偏差小、转染易、细胞死亡率降低的目的。

2.4 双荧光素酶报告基因检测系统优缺点

2.4.1 主要优点

（1）灵敏度高，微量的变化就可以激活较为强烈的信号

（2）能够在研究对象的遗传背景（研究品种原生质体）下进行检测

（3）可以借助瞬时表达系统进行检测

2.4.2 主要缺点

（1）受到转化体系中其他蛋白影响，不能完全证明蛋白与核酸直接结合关系。

（2）瞬时转化中存在许多干扰因素，容易对结果产生干扰。

植物研究中常用的，用于插入启动子的含萤火虫荧光素酶基因及海肾荧光素酶基因的pGreenⅡ 0800-LUC载体，用于插入miRNA靶序列的pGreenⅡ 0800-miRNA载体。

Coolaber已经推出基于双荧光素酶报告系统的植物转录活性检测试剂盒（MH103），参见往期推文《荧光素报告基因检测蛋白的转录活性》

2.4 实验流程

接下来以在植物中验证转录因子的转录活性为例，介绍双荧光素酶报告基因实验的基本步骤：

（1）质粒构建

转录因子过表达载体：将拟验证的转录因子插入pGreenⅡ 62-SK-BD载体中，使其与GAL4的BD结构域融合表达。

报告基因载体：pGreenⅡ 0800-35S-5×GAL4–LUC载体中含有GAL-TATA转录调控原件及FLUC主报告基因和RLUC内参报告基因。

（2）转染细胞/侵染烟草叶片

将转录因子过表达载体及报告基因载体共转化植物原生质体细胞或者通过农杆菌介导的瞬时转化法侵染烟草叶片。

（3）双报告基因检测

采用双荧光素酶报告基因检测试剂，提供荧光素和腔肠素底物及催化反应条件，利用酶标仪分别测定萤火虫荧光素酶的检测值（FLUC值）和海肾荧光素酶检测值（RLUC值）。

（4）统计学分析

计算FLUC与RLUC的比值，即为相对荧光活性值（Relative luciferase activity）。

EMSA实验

三、凝胶迁移实验-EMSA

凝胶迁移实验又称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种定性或定量分析蛋白-核酸相互作用的方法。最初用于研究转录因子与启动子的相互作用，目前同样应用于RNA结合蛋白与RNA的互作研究。EMSA实验能够监测核酸的电泳迁移速率。核酸可以被放射性同位素、共价/非共价荧光基团或生物素标记，进而能够通过放射自显影、荧光成像、化学发光成像分别进行监测。因生物素标记安全可靠无污染，可避免同位素对人与环境造成影响，在科研中广泛被应用。

3.1 EMSA实验原理

EMSA技术基于蛋白质-核酸复合物与核酸探针在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。首先蛋白质与末端标记的核酸探针结合，再进行PAGE电泳。电泳过程中蛋白质-核酸复合物迁移速率较慢，而游离核酸速率较快，因此从后续显影结果就可以判断目的蛋白是否结合特定核酸序列。

图 EMSA原理图

3.2 EMSA实验的应用

研究1 DNA结合蛋白和其相关的结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用。

可用于2 DNA定性和定量分析定性和定量分析。

用于研究3 RNA结合蛋白和特定的结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

3.3 EMSA实验的类型

（1）验证型 EMSA

用于验证探针是否含有可与蛋白质结合的位点。探针与纯化蛋白混合孵育，探针与蛋白结合与否，可以直接表明探针和蛋白的互作关系。结合突变，可以锁定蛋白核心结合序列。

（2）竞争型 EMSA

与修饰探针序列相同，但不含修饰基团的 DNA 片段称为竞争探针。在探针与蛋白质混合液中加入大量竞争探针，会干扰修饰探针与蛋白的结合。在电泳图的相应位置处，阻滞带的的信号会减弱或消失。

（3）超迁移 EMSA

如果蛋白质溶液不是单一的纯化蛋白，无论是验证型 EMSA，还是竞争型 EMSA，都无法完全证明和探针结合的蛋白质就是我们所验证的。在实验体系中引入特异性抗体，用抗体特异性地结合蛋白-探针复合物，这就是超迁移 EMSA。

蛋白-探针复合物被抗体识别并结合，该三聚复合物在凝胶电泳中，迁移速率再次增大，电泳带出现在蛋白-探针复合物的上方。超迁移 EMSA 是以竞争型 EMSA 为基础的实验方案。超迁移 EMSA 的实验结果可以很好的验证探针是否和蛋白结合，是否是特异性结合，与探针结合的蛋白是否是预期的蛋白质。

3.4 EMSA实验的优缺点

3.4.1 EMSA实验的优点

（1）能够证明蛋白与核酸直接的结合。

（2）在合适的条件下，在单个反应体系中就可以通过不同复合物的形成，检测不同蛋白与不同核酸分子之间的结合情况；

（3）能检测的蛋白大小范围很广，从小肽段到蛋白复合物都能检测，并且该实验既可以使用纯蛋白也可以使用细胞提取物。

3.4.2 EMSA实验的缺点

（1）在电泳过程中发生的快速解离会影响对复合物的检测；

（2）在EMSA实验中，复合物的形成与许多因素有关，并不能直接反映分子大小或者鉴定复合物中的各种蛋白质；

（3）EMSA在很大程度上属于定性实验，比如：可以检测蛋白-DNA复合物的形成与否，并不能精细的检测结合反应的上调或下调；

（4）EMSA实验中并不考虑体内环境中影响蛋白DNA结合的因素，比如染色质的结构对复合物形成的影响，因此，即使EMSA实验结果反映蛋白可以与DNA结合，在体内环境中也许还需要其它条件才能完成结合反应。

3.5 EMSA实验流程

目的蛋白表达纯化——探针合成与标记——蛋白与探针孵育——PAGE电泳——转膜——紫外交联——显影。

图 EMSA实验流程

为了快速简便的进行EMSA实验，Coolaber推出了化学发光法EMSA试剂盒。本试剂盒中的试剂添加了有效成分，可以促进DNA与蛋白质的特异性结合，并且在孵育洗膜过程中能有效去除背景信号，同时使蛋白质-DNA复合物的条带信号更清晰。

产品特点

本试剂盒提供了EMSA检测所需的结合缓冲液和上样缓冲液，及一些关键的相关试剂，可以实现非同位素的EMSA检测。可以用于100个蛋白和探针的结合反应，并足够检测至少10块有生物素标记EMSA探针的膜。

产品优势

1)安全环保：采用生物素对核酸进行标记，避免放射性同位素对人类及环境的污染，安全性高、适用范围广。

2)灵敏度高：探针检测灵敏度高，背景较低。

3)简单快捷：整个实验流程周期短，3-4小时内即可完成检测。

3.6 EMSA实验结果解读

EMSA实验通常包含3组反应来验证目的蛋白与核酸之间是否存在相互作用：

（1）第1组阴性对照反应：反应体系中仅含有标记探针，理论上探针的位置应该位于膜的最下方；

（2）第2组常规反应：反应体系中加入了目的蛋白与标记探针，理论上游离探针位置位于膜的下方，蛋白与标记探针复合物的滞留带在探针位置的上方；

（3）第3组竞争反应：反应体系中加入了目的蛋白、标记探针以及100倍量的未标记的探针。先用未标记的探针和蛋白孵育，通常探针都是过量的，理论上目的蛋白全部会与未标记探针结合，再加入标记的探针后，没有多余目的蛋白与之结合，则产生的结果为蛋白与非标记探针复合物的滞留带不能显影出现条带，而标记的探针位于膜下方。

3.7 常见问题解析

3.7.1 为什么背景过高？

1）曝光和成像时间过长；

2）封闭时间短或者效率低；

3）洗涤效果差；

4）实验过程中膜没有一直处于浸润状态；

5）转膜过程中工具或者膜被污染；

6）发生非特异性结合；

7）探针浓度过高。

3.7.2 为什么膜上有斑点？

1）转膜时尼龙膜与胶之间有气泡；

2） HRP标记的链霉亲和素中有杂质；