器官 + 单细胞测序绘结直肠癌细胞命运图谱（赠近 2 年 CNS 文献

摘要：随着癌症的发展，其侵袭性逐渐增强。转移性肿瘤对一线治疗的反应性比原发肿瘤差，它们对治疗产生抗性，最终导致患者死亡。然而目前人们对转移性癌细胞状态及其转变机制仍缺乏深入了解。

随着癌症的发展，其侵袭性逐渐增强。转移性肿瘤对一线治疗的反应性比原发肿瘤差，它们对治疗产生抗性，最终导致患者死亡。然而目前人们对转移性癌细胞状态及其转变机制仍缺乏深入了解。

2024年10月，来自美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心的K. Ganesh和D. Pe’er研究团队合作在期刊Nature（IF: 50.5）发表了一篇题为“Progressive plasticity during colorectal cancer metastasis”的研究文章。

本研究利用同一患者的正常结肠、原发肿瘤和转移灶样本揭示了结直肠癌转移过程中的细胞状态转变机制。

文章介绍

研究背景

Background

由于转移灶的外科切除较为少见，患者肿瘤进展过程中癌细胞状态的转变在很大程度上仍未被充分揭示。结直肠癌（CRC）治疗中常规会同时切除原发肿瘤、正常结肠组织及转移灶，为研究表型转变提供了一个独特的研究机会。

虽然CRC通常起源于LGR5⁺的肠道干细胞（ISC），但在肿瘤侵袭前沿，启动转移的癌细胞会进入一种LGR5low，L1CAM⁺的肿瘤再生状态。然而，从这些L1CAM⁺前体细胞发展而来的大型转移灶，其具体的表型状态、演变路径及其依赖机制，尽管在临床上极为关键，目前仍知之甚少。

研究思路

Methods

本研究围绕结直肠癌转移过程中细胞状态的变化，采用“正常组织–原发瘤–转移灶”三联体样本，从单细胞转录组入手，结合肿瘤类器官模型、化疗干预、异种移植和多种体外培养条件，构建了一个系统性研究框架。

研究首先通过单细胞分析描绘了从典型肠道分化状态向胎儿样再到非典型分化状态的连续轨迹；接着利用匹配来源的类器官模型探讨了肿瘤细胞的内在可塑性和微环境影响；进一步通过转录因子PROX1的功能干预明确其在限制非典型分化中的作用；最后结合预后数据，评估了非典型状态与临床结局之间的关联，提出其作为潜在生物标志物和治疗靶点的应用前景（图1a）。

图1a

研究结果

Results

1. 结直肠癌转移灶中干细胞程序下调

作者共对31位患者的83个样本进行了scRNA-seq。此外作者也收集了6位患者的第二次异时性转移灶切除组织。最终从处理后的数据中获得了47437个高质量的上皮细胞表达谱，对这些细胞进行了聚类分析，并利用InferCNV技术区分正常细胞与癌细胞，同时识别出了预期的肠道细胞类型。

首先分析来自9位未治疗患者的样本，以在不受治疗干扰的前提下研究肿瘤向转移灶的进展。主成分分析（PCA）发现，第一主成分（PC1）对应于肠道干细胞（ISC）特征。这一发现与此前关于原发肿瘤中LGR5表达细胞比例较高的观察结果一致。

基于未治疗正常结肠样本数据构建的一个全新ISC特征基因集显示（扩展数据图3b-c），相较于分化的肠道细胞，肿瘤细胞表现出更高的ISC特征表达。PC1还代表了一组与ISC不同的进一步上调的癌细胞程序，包括WNT信号通路基因、胚胎发育基因以及应激反应相关基因（扩展数据图3d-f）。

扩展数据图3b-f

正常细胞如预期般展现出严格的细胞类型特异性表达（扩展数据图3g），而未治疗的癌细胞则在同一细胞中共表达吸收型与分泌型肠道细胞程序，以及ISC特征基因（扩展数据图3g-j）。这种显著的谱系“混杂性”说明肠道正常分化层级的失调，以及癌症特异基因程序的获得，与其他类型癌症中的类似观察结果相一致。

扩展数据图3g-j

2. 转移灶中的非典型基因程序

癌细胞中细胞类型基因关联结构较弱（扩展数据图3g）反映出严重的表达调控紊乱，使得标准注释方法难以准确分类，因此作者转而采用无监督方法来识别协同变化的基因模块（即“基因程序”）。

假设协同变化的基因表达反映了为实现某种生物功能所需的协调基因调控机制，并且在癌症中，这些表达高度依赖具体的背景条件，如患者个体差异、局部环境等。

使用Hotspot工具来寻找那些仅在表现出特定细胞状态的细胞亚群中，表达协同变化的基因模块。与传统如Pearson相关性分析在整个数据集中寻找全局特征不同，Hotspot能在表型流形的局部细胞邻域中，识别出具有显著自相关性的基因模块。这些模块在不同患者中具有一致性，并能适应癌症中常见的基因多效性现象。

Hotspot在所有肿瘤上皮细胞中共识别出37个基因程序，经过人工整理与注释后，将其归类为10个在多个患者中共享的功能模块（图1b）。

图1b

其中4个模块对应于典型的肠道状态，包括ISC样状态、分化的吸收型和分泌型细胞。另外6个非典型模块则由高度共调控的非肠道谱系基因构成（图1b）。一个模块共表达L1CAM与EMP1，它们已被证实是LGR5low的CRC转移启动细胞的标志物，还包括与再生与治疗抗性相关的基因，如TACSTD2（编码TROP2）、CD70和OSMR。这些结果支持了一个具有肿瘤再生能力、不同于稳态ISC的独特转移启动细胞群体的存在。

此外，有2个与该损伤-修复模块紧密相关的模块，分别表达经典的上皮-间质转化（EMT）标志物和内胚层发育基因。还有3个模块表达与非肠道分化状态相关的基因，分别代表鳞状样、神经内分泌样和成骨样谱系。虽然正常结肠中也存在一些肠嗜铬细胞，但这些模块在癌细胞中的基因表达差异以及其在癌细胞中的广泛出现，提示存在一个与众不同的肿瘤神经内分泌细胞群体。

这些非典型的鳞状样与神经内分泌样模块在此研究的多数患者中均可观察到，尽管表达水平不一（图1c）。作者发现大量癌细胞失去了肠道谱系、同时获得了非典型分化身份，因此进一步进行了空间可视化及蛋白水平的验证。

对74个组织切片的多重免疫荧光分析（扩展数据图6a-f）显示，尽管原发肿瘤仍保留异常的隐窝结构，并继续表达肠道谱系的关键转录因子CDX2，但相比之下，分化肠道标志物CK20及ISC标志物OLFM4在转移灶中下调，而损伤修复标志物TROP2则显著上调（扩展数据图6a、c–e）。

图1c

扩展数据图6a-f

3. 非典型状态与不良预后相关

在配对的肿瘤样本中，作者发现转移灶中具有非典型基因表达的细胞数量显著高于同时切除的原发肿瘤（图1d-e）。即便在未经治疗的患者肿瘤中，作者也观察到神经内分泌样和鳞状样基因的表达（图1c），提示进入非典型状态不依赖治疗因素。

非典型模块的表达与肿瘤转移和既往化疗经历相关，并与结直肠癌共识分子亚型CMS4相对应，该亚型与不良预后密切相关，而典型模块则对应CMS2或CMS3（扩展数据图5e-h和6h-i）。综上所述，在结直肠癌转移过程中，肿瘤逐步丧失典型的肠道谱系特征，并获得非典型的基因表达特征。

图1d,e

图5e-h

图6h,i

为了评估非典型模块表达是否可作为临床预后的生物标志物，在两个独立的原发肿瘤bulk RNA测序数据集中进行了单样本基因集富集分析（ssGSEA）：TCGA结肠腺癌（I-IV期）患者队列，共445例；MSK的局部晚期直肠癌（II-III期）患者队列，共108例。

分析显示，非典型模块表达与不良预后相关，包括术后复发以及总生存期不超过10年（图1f-g）。分析总体提示，表达非典型模块的细胞亚群可能早在未经治疗的原发肿瘤中就已存在，并在转移过程中逐步富集，且这些细胞群体与不良临床结局密切相关。

图1f,g

4. 结直肠癌中存在“刻板”的细胞状态转变

为了阐明从典型状态向非典型状态的转变，作者分析了跨越转移过程的配对样本，其中重点观察了患者KG146的样本，其肿瘤细胞表现出最广泛的表型状态变化（图2a）。这组数据中最强变化轴所代表的扩散成分（DC1）反映了一种典型向非典型状态的演化路径——从分化的肠道谱系细胞过渡到ISC、非典型的内胚层发育状态，最终在转移灶中形成神经内分泌样和鳞状样的分化状态（图2a-b）。

另外三位患者（KG182、KG150、KG183）在非典型状态中也有足够多的细胞数量供分析，其细胞状态沿着顶层扩散成分的演化趋势与 KG146 高度一致（扩展数据图7a）。

作者特别关注的是，内胚层发育模块处于典型与非典型状态之间。这种“向更原始的发育状态暂时性回退”在组织再生和肿瘤生物学中都曾被报道过。以往有关“胎儿去分化”状态的大多数研究都基于小鼠模型，因此作者为了系统地刻画人类内胚层状态，利用了Human Cell Atlas提供的人类胎儿发育数据集。

分析显示，在妊娠第一期，结肠上皮细胞呈现出一种胎儿祖细胞样的状态；而到了第二期，就可以明显区分出肠道干细胞与分化的肠道细胞状态（图2c）。从中鉴定出了113个基因，它们在第一期胎儿祖细胞中高表达，而在第二期成熟肠细胞中低表达，构成了人类肠道胎儿特征基因集。

这个胎儿特征与已有的小鼠数据集存在明显差异（扩展数据图7b-c）。当将这个胎儿祖细胞特征绘制在肿瘤进展轴上时，发现其准确地标记出一个介于典型与非典型状态之间的中间状态（图2b）。

图2a-c

扩展数据图7a-c

进一步分析发现，每一个拥有足够非典型细胞的肿瘤，其细胞状态都沿着如下路径逐步演变：分化的肠道状态 → 肿瘤干细胞样状态 → 胎儿祖细胞状态 → 非典型的分化状态（鳞状或神经内分泌样）。为了分析其余患者队列的进展趋势，作者推测，如果大量细胞同时表达两个Hotspot模块，说明这两种细胞状态存在伪时间排序关系，反映出状态之间的过渡。

对所有模块对进行共表达分析后发现，无论在主数据集还是独立的参考数据集，都展现出一致的、逐步的演化路径（图2d-f）。因此表明，肿瘤进展过程中存在一种发育性“回退”，表现为细胞回到类似妊娠早期结肠祖细胞的原始状态，伴随着肠道谱系特征的丧失和WNT通路相关的早期发育程序的激活。

在LARC和TCGA两个队列中，原发肿瘤中胎儿祖细胞特征的高表达与无病生存期缩短显著相关（扩展数据图7g-h）。尽管在病人与肿瘤内部存在差异，这种胎儿祖细胞状态仍然表现为一种趋同的肿瘤再生中间状态，将典型状态与与临床不良结局相关的非典型状态连接起来。

图2d-f

扩展数据图7g,h

5. 非典型状态的决定因素

为了探究非典型分化是由癌细胞自身的变化驱动，还是由结肠与转移部位微环境差异所致，作者建立了配对类器官模型，这些模型保留了来源患者肿瘤的突变。为了控制微环境的变量，作者在标准人肠干细胞（HISC）培养基中培养类器官，该培养基含有维持干细胞状态的利基因子（图3a）。

作者聚焦于来自患者KG146的原发肿瘤（OKG146P）和肝转移瘤（OKG146Li）衍生的类器官，因为原发瘤以典型状态为主，而肝转移瘤涵盖了从典型到非典型的全谱系状态（图2b）。

通过“互为最近邻”映射方法将肿瘤中的表型状态对应到其类器官中，作者发现 OKG146P主要保留了干细胞样（ISC-like）表型，而OKG146Li则呈现干细胞样与内胚层祖细胞状态，但很少表现出体内观察到的非典型基因表达（图3b）。由此推测，HISC培养基中的生长因子可能抑制了非典型分化。

去除这些因子后，OKG146Li细胞丧失了肠道特征并获得非典型基因表达，而OKG146P细胞则依然表达肠上皮相关基因，且分化肠道标记表达水平有所上升（图3b）。因此，来源于体内非典型表达更强的肿瘤的类器官，其癌细胞表现出更强的细胞自主可塑性，可根据环境信号上调多种非典型谱系的基因。

为了判断这种适应肠道与肝脏微环境的内在能力差异是否在体内保留，作者将类器官异种移植至NSG小鼠的盲肠。结果发现，无论是来源于原发瘤还是转移瘤的类器官在盲肠内均能以相似的速度形成原位肿瘤（图3c），但当注射至肝脏后，只有OKG146Li类器官能适应肝脏微环境并生长，而OKG146P无法存活（图3d）。

图3

为研究治疗与非典型基因表达的关系，作者将原发瘤与转移瘤类器官分别用转移性结直肠癌一线化疗药物伊立替康的半抑制浓度剂量处理7天，发现非典型模块及胎儿特征基因的表达均有所增加（扩展数据图10）。

因此，不论是转移还是化疗——这两种会破坏上皮细胞之间接触的“上皮损伤”形式——都与高度可塑的、具有多谱系肿瘤再生潜能的细胞状态相关。

扩展数据图10

6. PROX1在胎儿状态中抑制非典型命运

作者假设，在胎儿状态中存在某种转录因子,可以在原发肿瘤中限制细胞的可塑性。沿着典型到非典型的扩散主成分（DC）轴，识别出5个与胎儿特征紧密共表达的转录因子（扩展数据图11a）。只有3个在接受伊立替康（一种诱导组织损伤修复与胎儿状态的化疗药物）治疗后被上调（扩展数据图11b）。

在这些转录因子中，多功能同源盒转录因子PROX1 表达最为显著上调，在我们的数据和Wang等人研究的数据集中，PROX1 的表达与非典型模块基因正相关，与典型模块基因负相关（扩展数据图11c）。

多重免疫荧光验证显示，PROX1 在原发瘤侵袭前沿、低CDX2表达的低分化癌细胞中表达，提示它可能在受损肠道上皮中抑制非典型分化（扩展数据图11d）。PROX1在正常肠上皮的损伤诱导型再生细胞中表达，并且在修复过程中对恢复典型肠道分化状态是必需的。在小鼠结直肠癌模型中，原发瘤侵袭性的增加也伴随PROX1转录抑制活性的增强。

扩展数据图11

因此推测，为了实现转移瘤中的非典型分化，癌细胞需要克服PROX1所施加的谱系限制。在OKG146P类器官中敲低PROX1会显著诱导非典型基因表达，而在OKG146Li中则只诱导少量的肠道和非典型分化基因，说明在后者中PROX1对非典型基因的抑制作用减弱（图4a）。

为了进一步探究细胞状态背景的作用，作者构建了5个新的类器官系，并检测了OKG146单细胞数据中变化显著的关键基因。在更偏典型的类器官系（如OKG136P、OKG136Li和OKG146P）中敲低PROX1可诱导多个非典型基因（如鳞状标记KRT23和ELF5、神经内分泌标记GNAI1和POMC），而在最偏非典型的类器官系（OKG182CW2和OKG183Li2）中则未观察到类似变化（图4b）。这说明PROX1对非典型基因的抑制作用依赖于肿瘤细胞当前的谱系状态。

即便在最非典型的类器官中，也只有一小部分仍对PROX1敏感的非典型基因会在PROX1敲低后上调（图4b）。跨类器官系比较显示，PROX1敲低对典型基因的表达并无一致性影响。在功能上，敲低PROX1并不足以诱导来源于原发瘤的类器官（OKG146P和OKG136P）在小鼠肝脏中形成转移灶（跟踪12周），说明PROX1介导的非典型分化需与其他表型驱动因素协同作用，才能推动转移灶的形成（扩展数据图12d,e）。

作者进而假设，一个“许可性”细胞状态对于PROX1抑制非典型分化是必要的，这样才能在类器官形成过程中重新进入肠干细胞状态。于是我们使用单细胞再生类器官实验，在包含shControl和shPROX1的不同类器官系中评估其再生能力。

结果显示，PROX1所依赖的干细胞功能取决于细胞状态背景：偏典型状态在敲低PROX1后再生类器官的能力下降，而偏非典型状态则不依赖PROX1（扩展数据图12f-g）。综上，研究提出一种模型：PROX1 所驱动的谱系限制、干细胞功能与肿瘤再生能力具有特定的细胞状态依赖性。随着癌症发生转移或接受治疗，肿瘤会逐渐选择更不依赖 PROX1、更少谱系限制的细胞状态（图4c）。