摘要：在不损坏样品的情况下从细胞获取断层信息一直是生物医学成像中一个具有挑战性的问题。传统的相位显微镜，通常仅捕获样品的相位信息面临信号丢失和执行断层成像时的分辨率限制。这些问题使传统的相位显微镜不适用于细胞断层扫描成像。光学相干断层扫描(OCT)共聚焦显微镜虽然通

在不损坏样品的情况下从细胞获取断层信息一直是生物医学成像中一个具有挑战性的问题。传统的相位显微镜，通常仅捕获样品的相位信息面临信号丢失和执行断层成像时的分辨率限制。这些问题使传统的相位显微镜不适用于细胞断层扫描成像。光学相干断层扫描(OCT)共聚焦显微镜虽然通常用于断层扫描成像，但具有他们自己的局限性。OCT的分辨率通常不足以揭示细胞的精细内部结构，尤其是亚微米级需要解决。同样，共聚焦显微镜在分辨率和由于光散射和吸收。近年来，已经开发了各种用于高分辨率的先进技术生物样本的三维成像。为了克服传统成像限制并实现更高分辨率断层成像，因此需要新的成像方法。

光场透射矩阵理论提供了一种新的理解和处理光场成像的视角。该理论表明，单个散射光子可以通过奇异值传输或反射矩阵的分解(SVD)。基于此原理下，已经开发了各种技术，例如深度聚焦和散射介质中的成像，时间反转成像和区分单散射光子和多散射光子。这些技术显着提高光学成像分辨率和深度，并提供理论支持进一步的技术创新。

在该文中，一种基于透射矩阵的相位显微镜技术是建议用于细胞的高分辨率断层扫描成像。此方法简化了成像过程，只需一次测量即可捕获细胞的全面相位信息。捕获的数据为用于构造传输矩阵，该矩阵通过SVD使提取不同深度的结构细节。此功能有助于对内部细胞结构进行详细和精确的成像。红细胞的实验结果显示细胞内最小厚度为5 nm的结构。此外，该技术在区分白细胞类型中的应用展示了其有效成像和识别独特细胞的结构特征。横向分辨率可以是在100 nm范围内实现。这些结果强调了广泛的该方法在生物医学研究中的适用性，并突出其有可能成为细胞生物学研究和医学的有力工具诊断。该文章以“Computational tomography: high-resolution tomographic cell imaging via transmission matrix”为题，发表于期刊Optica。

图1(a)说明了实验配置，它基本上是一个白光衍射相控显微镜(wDPM)。该wDPM采用同轴离轴方法，利用白光促进快速数据捕获和提高时间-时间响应性，同时显著降低散斑噪声。在操作方面，wDPM作为一个补充组件集成在商业显微镜平台上（奥林巴斯IX73倒置光学显微镜）。显微镜的照明来自卤素灯，提供空间相干白光（中心波长为574 nm，带宽为275 nm），这是大多数商用显微镜的标准特征。此外，显微镜还配备了一个40×(0.65 NA)的明场物镜。在wDPM配置中，一个光栅周期为10 µm的衍射光栅位于显微镜的成像平面上，从而可以创建包含标本完整空间信息的多个衍射阶。零阶和一阶光束的分离是通过位于傅立叶平面上的针孔滤波器实现的，该滤波器由透镜L1产生，焦距为150 mm。零阶光束进行空间低通滤波，只允许其DC分量通过，而一阶光束分量则允许不受阻碍地通过。傅立叶平面上的针孔（零阶掩模）直径为200 µm，矩形开口（一阶掩模）尺寸为10 mm×5 mm。由L1和L2组成的透镜组件（每个焦距为150 mm）构成了一个高度稳定的马赫-曾达干涉仪，其中一阶光束作为成像场，零阶光束作为参考。这两束光束之间的干涉产生空间调制的干涉图样，随后由成像平面上的灰度CCD相机捕获，目标尺寸为6.50 mm×5.25 mm，分辨率为2600×2160像素，像素尺寸为2.50 µm×2.50 µm。在获得干涉数据后，对其进行系统处理，并采用图1(b)所示的方法重建相位图像。

测量得到的时间灵敏度为0.3796 nm，如图2(a)所示，而空间灵敏度确定为1.7822 nm，如图2(b)所示。

CCD记录数字全息图后，利用傅立叶变换算法(FTA)对相位图进行重构。将参考光束和目标光束分别定义为R(x,y)和O(x,y)，然后可以表示出数字全息图的强度分布和数字全息图光谱。在离轴数字全息中，物体光谱、零阶光谱、共轭光谱之间互不重叠，因此可以通过数字滤波直接得到物体光束的相位分布。然后，使用离散余弦变换(DCT)方法进行相位解包裹。

为了更好地理解和处理散射模式，引入了传输矩阵理论。该理论允许对光场进行深入分析，研究光子在介质内的传播路径和相互作用。通过这种分析，可以准确地识别和分离透射光子，并将散射光子和噪声成分相乘。如图1(c)所示，在成像系统获取样品的光场信息后，下一步是构建宽视场照明下的透射矩阵。具体来说通过使用滑动窗口，可以在每个像素处获得局部光场分布信息。3×3像素窗口用于捕获小尺度光场变化，确保精确的细节获取。根据采样位置系统地排列光场，形成透射矩阵。重建传输矩阵后，对其进行SVD。通过对传输矩阵进行SVD，可以得到散射方向图的统计特征。

光通过介质时，既被吸收又被散射。数据的奇异值代表了光子在介质中的传输信息。所有奇异值值呈现指数衰减，如图1(d)所示。大的奇异值对应于单个散射光子，而小的奇异值对应于多个散射光子。同时，奇异值也编码深度信息:较大的奇异值表示较少的吸收和散射，对应较浅的层，如图1(d)红色区域所示。相反，较小的奇异值表示吸收和散射较多，对应较深的层数，如图1(d)的绿色和棕色区域所示。因此，选择不同的奇异值进行重建将得到样品在不同深度的图像。

为了验证基于传输矩阵的层析成像在散射介质中的可行性，进行了电场蒙特卡罗(EMC)模拟实验。在模拟中，设计了一个“三明治”结构样品，如图3(a)所示。样品的输运平均自由程(lt)为1.04µm。样品主要由三层组成:衬底层厚度为10 lt，透射系数g=0.206；成像靶具有尺寸为13µm的分辨率图，在3 lt和5 lt深度以交错方式排列，透射系数g=0.047。在中心波长为574 nm的空间相干白光照射下，捕获了样品的散斑相位图像，如图3(b)所示。这些散斑图像提供了对样品内部结构的初步了解。随后，根据图3(c)中描述的方法构建传输矩阵，并进行SVD处理。图3(d)和3(e)给出了基于奇异值的不同深度的成像结果，奇异值对应于预期目标。这表明，基于传输矩阵的断层成像不仅在理论上可行，而且能够在散射介质中精确重建目标结构，从而为该技术在实际场景中的高分辨率成像应用奠定了基础。

为了验证该成像技术的高轴向分辨率，使用直径为2 µm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球进行了实验。由于其不透明性，单个微球只能捕获约一半的信息，将成像深度限制在约1 μm。图4(a)显示了PMMA微球的成像区域。图4(b)和图4(c)分别显示了使用相位提取技术获得的重构相位光场及其三维相位分布。在图4(d)中可以看到一个清晰的半球形结构，从不同角度显示了PMMA微球的三维视图。利用基于特征值的相位层析重建，获得一系列不同深度PMMA微球的相位层析图像，如图4(e)所示。图4(f)描绘了PMMA微球的层析结构模型。沿着图4(f)中虚线标记的横截面提取代表这些相位层析图像中线处强度的二维图像，如图4(g)所示。图4(h)给出了图4(g)中虚线沿线的强度分布，其中160个像素对应于1µm的近似厚度，每个像素平均为6.25 nm。折线图中的峰值波动进一步证明了轴向分辨率的性能。这些结果证实了该技术在高分辨率显微成像中的准确性和可靠性，为生物医学成像和纳米技术研究提供了关键的技术支持。

为了证明该技术在细胞层析成像中的能力，使用红细胞进行了成像实验。最初，相位显微镜捕获原始光场图像，如图5(a)所示。随后应用相位提取技术重建相位光，如图5(b)所示。图5(c)显示了重建的phaselightfield的三维分布，图5(d)展示了使用不同奇异值在不同深度重建的estomographicphase图像，揭示了内部结构的横截面视图。图5结果表明，选择合适的奇异值进行光场重建可以有效地提取不同深度的细胞信息。这些图像有助于详细观察形态变化和识别结构特征，如膜波动和内部成分的分布。血红蛋白是红细胞的关键成分，其直径约为5 nm，而细胞的总厚度约为2 µm。通过微调奇异值间隔，层析成像可以将结构分解到5 nm以下，从而可以观察到细胞的内部结构，包括血红蛋白的分布和形态。这些层析成像图像为红细胞结构提供了有价值的见解，证明了层析成像技术在细胞成像方面的有效性和广泛适用性。

为了验证所提出的细胞成像方法的高横向分辨率，对白细胞进行了成像实验。图6(a)显示了嗜碱性粒细胞的原始相位光场。图6(b)是由(a)导出的3D等高线图，它清楚地说明了细胞的分层。然而，细胞结构和组成的复杂细节在等高线图中是看不出来的。图6(c)显示了它的3D断层成像图像，揭示了细胞独特的形态特征。如方框所示，嗜碱性粒细胞细胞质内的细胞核清晰可见，为其在不同病理状态下的功能活动提供了基础认识。图6(d)显示了从图6(a)重建的层析相图像，聚焦于特定深度。将其与图6(b)进行比较，可以看出，在wDPM的帮助下，相位层析成像基于透射矩阵理论的方法可以提取更多的细胞内信息，并实现小于100 nm的高横向分辨率。图6(e)显示了图6(f)中方框所示区域的放大细节。不同的器官和细胞膜可以清晰地可视化，这对于理解细胞的生理功能和免疫反应的动态行为至关重要。图6(f)进一步显示了不同深度的层析结构，揭示了细胞内颗粒的分布和细胞质内容物的分层，从而对嗜碱性粒细胞的结构和功能有了更全面的了解。图6(g)显示了图6(f)中线条所示的100 nm左右的图像细节。图6(h)显示了沿图6(g)所示线的相位强度分布。相位强度分布不是直线而是折线，表明该方法的横向分辨率小于100 nm。这些高分辨率断层图像突出了该技术在区分各种细胞类型方面的强大适用性。图6(i)展示了单核细胞的原始相光场。与图6(a)相比，只能看到表面形态差异，而无法观察到更深层次的结构差异。图6(j)为单核细胞的三维层析图像，揭示了清晰的三维结构细节，特别是细胞核和细胞质的分布。图6(c)和图6(j)中的方框清晰地区分了两种类型的胞内细胞核。图6(k)进一步说明了单核细胞的分层结构，从而可以观察到关键特征，例如细胞质成分的排列和细胞膜在不同深度的完整性。识别和分析特定的细胞类型对于疾病诊断和细胞功能研究至关重要。实验结果进一步验证了这种层析成像技术的效率和准确性，为细胞微结构细节提供了清晰、精确的可视化。该研究为该技术在细胞生物学和医学诊断中的应用奠定了坚实的基础，为无创、快速细胞成像技术的发展提供了新的方向。

综上，该文提出了一种基于透射矩阵的相显微镜技术，用于细胞的高分辨率层析成像。红血球的实验结果表明，该技术具有清晰显示细胞内部结构的卓越能力，轴向分辨率约为5 nm。此外，该技术在区分白细胞类型方面的应用也证明了其有效成像和识别细胞独特结构特征的能力。该技术实现了100 nm的横向分辨率。这种创新的方法不仅为细胞生物学研究提供了强大的工具，而且在医学诊断和其他相关领域的应用也显示出巨大的潜力。

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来源：凯视迈精密测量