摘要：近年来，随着合成生物学与蛋白质工程的蓬勃发展，以及人工酶和光酶催化等创新性交叉融合策略的开发，酶催化合成逐渐成为提升“新质生产力”的重要手段之一。尽管取得了一定进展，但是相较于化学合成，酶催化的反应类型依旧有限。

近年来，随着合成生物学与蛋白质工程的蓬勃发展，以及人工酶和光酶催化等创新性交叉融合策略的开发，酶催化合成逐渐成为提升“新质生产力”的重要手段之一。尽管取得了一定进展，但是相较于化学合成，酶催化的反应类型依旧有限。

南京大学化学化工学院黄小强（点击查看介绍）小组聚焦于化学催化和生物催化的交叉领域，通过酶学机制设计和蛋白定向进化改造策略，成功重塑了几类酶的催化功能，突破了不对称生物合成的边界。在光酶催化领域，黄小强团队和合作者前期构建了光与焦磷酸硫胺素依赖酶的协同催化体系（Nature 2024, 625, 74. 点击阅读详细; Nature 2025, 637, 1118）、开发了可见光直接激发的黄素依赖自由基酶（Nat Catal2023, 6, 996. 点击阅读详细）、重塑了烟酰胺依赖的亚胺还原酶（JACS 2024, 146, 14278, 点击阅读详细）、开发了一类路易斯酸型人工金属酶（ACIE 2025, e202500338）。近日，该小组在不对称电酶催化领域取得新突破：通过二茂铁介导的电化学氧化重塑焦磷酸硫胺素（ThDP）依赖酶，解锁了一例非天然的电酶催化动态动力学氧化新转化（图1）。该工作于2025年5月28日在Nature 期刊发表。

图1. 电酶催化现状及本文研究。图片来源：Nature

电化学合成作为合成科学领域的重要工具，具有清洁、廉价和可再生等多重优势。目前，电化学与酶催化的结合主要集中在以下两类：（1）通过电化学来实现酶辅因子的再生，继而实现酶的天然反应；（2）电化学生成的中间体或底物参与后续酶催化天然转化中（电化学/酶级联）。相较而言，利用电化学驱动酶催化非天然功能的发展远远滞后（图1a）。关键挑战在于：电极与酶之间的非均相电子转移效率低，动力学不匹配或低效的电子转移会阻碍非天然酶促中间体的生成，阻断非天然反应的发生。此外，同时还需考虑体系的兼容性、如何抑制酶的天然反应等问题。因此，构建一个全新的电酶催化体系，解锁酶的非天然反应性，实现电能驱动的高效不对称酶催化仍亟待突破。

黄小强小组巧妙地融合了二茂铁甲醇介导的阳极氧化和ThDP依赖酶催化的自由基过程，将连续2次单电子氧化机制引入酶中，并结合定向进化技术理性改造酶的活性位点，成功开发了一例电酶催化非天然转化（图1c），开辟了"电驱动酶催化"不对称合成新方向。该体系能以清洁电能替代传统化学氧化剂，可在较低酶负载量下，实现布洛芬、萘普生等十种(S)-丙酸类抗炎药物的高效合成，对映选择性高达99% ee，并兼容全细胞催化与规模化制备。

在前期硫胺素依赖的光酶催化研究中，该团队发现大量底物醛到羧酸的副产物，并推测其来源于酶-底物形成的Breslow中间体的过度氧化。因此，本研究选择以外消旋2-([1,1'-联苯]-4-基)丙醛为模板底物，含有ThDP和Mg2+的MOPS（pH = 6.5）为缓冲液，二茂铁甲醇（FcMeOH）为电介质，廉价易得的石墨电极为阴阳极，探索电酶的立体选择性氧化过程。最终，在0.4 mA恒流电解的条件下，通过对多类不同物种来源的ThDP依赖酶的系统评估，团队筛选到源于来乳酸乳球菌的支链酮酸脱羧酶（KdcA，PDB number：2VBF），在最优条件下能以70%产率和97% ee对映选择性获得目标产物。该体系可以在0.05 mol%酶的负载量以及全细胞的条件下，完成目标催化转化，最高TON达1320。控制实验表明，KdcA酶、电流和电介质都是体系中必不可少的关键因素（图2）。

图2. 条件筛选与规模化制备。图片来源：Nature

该电酶催化体系展现出卓越的底物普适性与官能团兼容性（图3）。针对结构多样的外消旋α-支链醛类化合物，可实现精准的手性控制，高效转化为α-手性羧酸产物（最高99% ee）。文章展示了25个例子，实验成功制备了十种 (S)-丙酸类药物（2p-2y），包括氟比洛芬、布洛芬、萘普生等，产率良好至优异，对映选择性最高达99% ee。同时，该电酶催化方案能够以相当的效率和对映选择性放大到1 mmol级别（图1e，0.5 mol%酶用量，25 mol%电介质用量）。

图3. 底物谱拓展。图片来源：Nature

该团队随后设计了系列实验来探究该电酶体系的可能机理，主要包括：1）外消旋化是如何发生的；2）解析对映选择性识别步骤；3）电子是如何传递的。

为探究外消旋化是如何发生的，作者首先制备了对映体纯的 (S)-1p与 (R)-1p底物，分别在标准条件进行实验（图4a）。结果显示，两种对映体均能以优异对映选择性转化为S-构型的产物，符合动态动力学拆分的机制。其次，通过对反应过程中不同时间点外消旋底物rac-1p的对映选择性实时监测，发现剩余底物中R-构型对映体逐渐富集，这表明酶能特异性识别S构型底物（图4b）。随后，作者以(R)-1p和(S)-1p为起始原料，补充了一系列的控制实验，结果表明：在不加辅因子只加蛋白的实验中，蛋白质中的碱性残基（而非酶促Breslow中间体的形成）促进了底物的外消旋化过程。

为探究对映选择性识别机制，作者分别对(S)-1p与(R)-1p衍生的酶促Breslow中间体（即Int. B，图4h）的不同构象进行分子动力学（MD）模拟。模拟结构分析表明S-构型底物结合自由能更低为−57.3 kcal/mol，在酶活性位点中更受偏好（图4e）。这与电酶催化体系中高选择性地生成S-型的产物相吻合。通过进一步对结构模拟分析与突变实验，验证了H112、D26与E462对催化的重要性，可能共同决定了 S-底物的结合优势。

为揭示电子转移过程，作者开展了循环伏安法（CV）研究（图4d）与低温电子顺磁共振（EPR）实验（图4g）。结果表明：电介质可以高效地介导电极与酶促Breslow中间体发生单电子转移，且EPR谱中也能检测到相关自由基信号。作者测定了多种酶的动力学参数，研究发现催化效率与电子转移能力之间的正相关性——较高的TOF往往伴随着更高效的电子转移过程，这使得CV曲线特征变化与EPR信号检测更为显著（图4f）。

图4. 机理探究。图片来源：Nature

基于上述实验结果，作者提出可能的反应机理（图4h）。首先，ThDP辅因子的卡宾形式（Int. A）以高度选择性（虽非绝对专一）方式与(S)-1缩合，生成对应的Breslow中间体(S)-Int. B。同时，FcMeOH在阳极被氧化为高价态，进而将Int. B单电子氧化为可能的自由基中间体Int. C。随后，Int. C被氧化态的电介质进一步单电子氧化，生成酰基唑阳离子Int. D。最后，Int. D经水解生成(S)-2，并再生酶结合的卡宾中间体Int. A。与此同时，蛋白质骨架促进的底物外消旋化过程持续将底物消旋，从而实现动态动力学拆分。

该工作通讯单位为南京大学配位化学全国重点实验室、化学和生物医药创新研究院、化学化工学院、前沿交叉科学研究中心。论文的理论计算部分由南京大学化学化工学院朱琴老师完成，电子顺磁共振实验部分由中国科学技术大学/中国科学院强磁场科学中心于璐教授团队完成，其余部分由南京大学黄小强课题组完成。南京大学化学化工学院博士研究生赵贝贝和许园园为论文的共同第一作者；黄小强特聘研究员为通讯作者。该工作得到了南京大学启动经费、国家重点研发计划项目（2022YFA0913000）、国家自然科学基金（22225703, 22277053, 224B2705, 223B2703, 22437005）、中央高校基本科研业务费专项基金项目（0205/14380346）等项目的支持。

Electricity-driven enzymatic dynamic kinetic oxidation

Beibei Zhao, Yuanyuan Xu, Qin Zhu, Aokun Liu, Xichao Peng, Tianying Zhang, Lu Yu, Yan Zhang, Xiaoqiang Huang

Nature 2025 DOI: 10.1038/s41586-025-09178-6

黄小强，南京大学化学化工学院特聘研究员、国家青年人才（海外）、科技部重点研发计划青年首席，以通讯作者身份在Nature（3）、Nat. Catal.等期刊发表多篇酶催化研究成果。实验室正在招聘化学合成和AI方向的博士后/博士研究生，欢迎咨询课题组主页：

来源：X一MOL资讯