摘要：傅里叶变换高光谱显微镜（FT-HSM）的示意图见图1，激发光由一台波长λ = 532nm的倍频Nd:YAG激光器（NPS，Bright Solutions，意大利帕维亚）产生，通过一根400μm芯径的多模光纤与显微镜耦合，经二向色镜（DM）反射后，再通过显微镜
傅里叶变换高光谱显微镜（FT-HSM）的示意图见图1，激发光由一台波长λ = 532nm的倍频Nd:YAG激光器（NPS，Bright Solutions，意大利帕维亚）产生，通过一根400μm芯径的多模光纤与显微镜耦合，经二向色镜（DM）反射后，再通过显微镜物镜射出。物镜可根据所需放大倍数进行更换：在本研究中，我们使用了10×（数值孔径0.30）、20×（数值孔径0.40）和100×（数值孔径0.75）的物镜。一个中继系统将光纤尖端成像在物平面上，形成一个均匀的（平顶）照明光斑（覆盖视场直径的82%）：拉曼信号依次穿过一个532nm的长通滤波器（LPF），用于阻挡残留的激发光；一个650nm的短通滤波器（SPF），用于去除拉曼位移较大（>3412cm^-1）的荧光，然后成像在二维探测器上。
测量时，TWINS每设置一个延迟，就在二维探测器上采集一帧数据。拉曼信号常与强烈的自发荧光背景重叠。傅里叶变换高光谱显微镜（FT-HSM）方法具有独特优势，能将这两种信号区分开。这是因为宽带荧光产生的干涉图在延迟初期有少量振荡，而窄带拉曼场在延迟较大时会有持续振荡。实际上，利用这一特性，我们只需选择扫描范围，就能分别获取荧光或拉曼信号。因此，为抑制荧光信号的光谱特征，扫描起始点设置为34fs 。
FT-HSM技术的最后一个优势是在光谱分辨率选择上的灵活性，这取决于延迟间隔的长度。在后续研究中，我们将采用两种扫描间隔（详细信息见表1）：（i）长扫描，能提供FT-HSM所能达到的最高光谱分辨率（23cm^-1），但测量时间会更长；（ii）短扫描，测量速度比长扫描快约4.5倍，但光谱分辨率较低（105cm^-1）。采集到的时域干涉原始数据首先通过奇异值分解（SVD）去噪进行预处理，以提高信噪比，然后对每个像素的干涉图进行傅里叶变换，获取相应的光谱。通过对光谱数据集应用端元提取算法（MCR或N-FINDR），得到成像视场中不同拉曼特征的空间分布图。所有预处理步骤和数据分析均使用内部软件完成。
拉曼傅里叶变换高光谱显微镜识别和表征微塑料的能力最初是通过商用微塑料进行测试的。我们从不同的意大利公司选取了各种聚合物类型、形状和大小各异的颗粒：（i）聚丙烯（PP，50-1000μm）、聚氯乙烯（PVC，30-230μm）、聚乙烯醇（PVA，50-150μm）、聚乙烯（PE，20-500μm）、聚苯乙烯（PS，50-1000μm）的碎片；（ii）聚酯（PET，长度618±367μm，直径13±1μm）和聚酰胺（PA，长度566±500μm，直径11±1μm）的纤维；（iii）聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和聚苯乙烯（PS）的微珠，直径均为3μm。实验分别对单一类型和混合的微塑料进行了分析，这些微塑料被放置在不会产生拉曼信号的铝制基底上。实验采用短扫描，并测试了不同的采集参数组合，如像素合并、辐照度和积分时间，以评估系统的性能和通用性。
拉曼傅里叶变换高光谱显微镜还用于测试其分析非商用微塑料的能力。为此，微塑料是通过将在一个国际项目（RESPONSE JPI Oceans）框架下海滩清洁活动中收集的塑料碎片进行微细化处理得到的，这些塑料碎片此前已用于生态毒理学研究。简而言之，PET瓶被微细化处理，得到尺寸小于20μm的微塑料（以下称为PET瓶微塑料）。与商用微塑料的处理方式相同，PET瓶微塑料被放置在惰性铝制基底上。在此次采集过程中，我们使用了20×的显微镜物镜。首先，我们以低光谱分辨率进行测量，以确定视场中是否存在微塑料（见SI中的图S1），然后再进行高分辨率扫描。样品上的激光功率为230mW（辐照度：270W/cm^2）；通过应用2×2的硬件像素合并，进一步增强了信号，得到了一幅251,500像素的图像（相应的像素采样约为0.8μm，与衍射极限空间分辨率相当）。每帧的曝光时间设定为约450ms，整个延迟扫描时间为36分钟。
第二次测量针对的是尺寸在20-50μm范围内，由PE、PET、PP、PS和PVC组成的微塑料混合物。这种混合物（以下称为微塑料混合物）是通过将海滩上收集的硬塑料容器微细化处理得到的，在使用孔径为8μm的混合纤维素酯（MCE）膜进行常规真空过滤之前，将其添加（掺入）到1L预先过滤的海水中。我们选择这种膜是因为与尼龙和醋酸纤维素（CA）相比，MCE的拉曼信号更低（见SI中的图S2）。与PET瓶的情况一样，我们使用20×显微镜物镜，激光辐照度为270W/cm^2，并先以低光谱分辨率进行初步测量（见SI中的图S4），以确定视场中是否存在微塑料。随后进行的高分辨率测量（光谱分辨率：23cm^-1）使我们能够分辨出与表格中聚合物光谱可能存在的偏差，这种偏差在环境中的微塑料中较为常见。应用4×4的像素合并，得到一幅62,500像素的图像（像素采样：约1.6μm），每帧曝光时间设定为200ms，总测量时间为19分钟。
在本阶段，我们从亚得里亚海的渔民那里获取了8条鲭鱼（Trachurus trachurus）样本，并按照已验证的生物基质处理程序，对其胃肠道进行处理以提取微塑料。简而言之，组织用10%的氢氧化钾（KOH）溶液处理（在50°C下孵育），以完全消化有机物，然后在MCE膜（孔径8μm）上进行真空过滤。使用10×物镜，通过拉曼傅里叶变换高光谱显微镜对样品进行分析。为进一步验证结果的准确性，还在立体显微镜下对滤膜进行了检查，并使用μATR-FTIR光谱（Spotlight 200i FTIR显微镜系统，PerkinElmer；见SI中图S9的红外光谱）对识别出的颗粒进行分析，μATR-FTIR光谱是一种广泛认可的微塑料表征有效方法。
为防止空气传播和交叉污染，在过滤过程中采取了多项预防措施。
对商用微塑料的测量使我们能够评估仪器的性能和通用性，包括识别不同形状、大小和聚合物组成的微塑料的能力，以及分辨小于10μm颗粒的能力，其空间分辨率远低于μ-FTIR的极限。
如图2所示，我们的FT-HSM系统能够有效地检测微塑料的拉曼信号，并根据其光谱特征在采集的视场中识别其特性。即使是快速扫描（低光谱分辨率，见表1），得到的谱带（图2a）也与文献中报道的主要拉曼峰相符，足以初步区分聚合物类型。这一结果证明了拉曼傅里叶变换高光谱显微镜相较于标准μ-拉曼系统的优势，即通过牺牲光谱分辨率而非空间分辨率来缩短总测量时间：当需要快速研究大视场，且区分微塑料与非聚合物颗粒比精确分类其拉曼特征更为重要时，这种方法至关重要（见SI中图S4，比较微塑料光谱与非聚合物物质光谱）。
测量参数以及显微镜物镜是根据不同类型的微塑料进行调整的，总结见表2。像PP（图2b）和PVC（图2c）这种表面不平整的大碎片，存在许多离焦贡献：因此，对于这些测量，我们选择放宽空间分辨率，采用高CCD像素合并来提高信噪比，而不是向样品施加高激光辐照度。实际上，在大样品中，内部产生的光热负载向环境的耗散通常比小碎片更慢。相反，对于小尺寸或扁平的微塑料（图2d-f），识别微小特征很重要，我们使用低CCD像素合并以获得高空间分辨率，并提高激光辐照度以改善信噪比。图2g中塑料微珠的测量是个例外，使用100×物镜提供的高放大倍数，即使采用6×6的像素合并，也能实现足够的像素采样。图2中最后一次测量以及面板 (e) 和 (f) 所示的测量结果表明，我们的拉曼傅里叶变换高光谱显微镜能够在同一视场中有效分离不同的聚合物种类，并检测小至3μm的微塑料。
图3展示了对铝基底上PET瓶微塑料的分析结果：除了微塑料，我们还检测到了碳酸钙（CaCO_3）颗粒，通过其在1088cm^-1处的典型谱带（对称伸缩振动，\nu_1 ）进行识别。这种物质的存在是预期的，因为它是沙子中最常见的成分之一，主要来源于钙质贝壳和死亡海洋生物的骨骼。此外，我们需要考虑到，无论是海滩塑料还是PET瓶微塑料，都未进行预处理以去除无机物质（例如通过洗涤、密度分离等方法）。
没有重叠峰这一现象证明了该仪器能够在同一基质中有效区分合成聚合物与非聚合物材料，且无需对样品进行预处理。这对于可靠测定环境样品中的微塑料非常重要，因为通过振动光谱技术进行微塑料识别时，大多数漏检或错误识别都与塑料物品表面自然存在的物质的背景噪声和荧光有关。如果材料无法通过化学消化去除（例如矿物质），或者样品未进行消化处理（如海滩沙子，由于其有机物含量较低，被认为是比潮下带沉积物 “更清洁” 的基质），这种情况尤其容易发生。
材料本身或塑料添加剂（例如颜料）产生的荧光会影响微塑料样品的拉曼散射，引入强烈的背景信号。Penalver等人以及Gonzalez-Fuenzalida等人在比较原始和回收PET容器的拉曼光谱时强调了这一点。实际上，回收材料显示出更高的荧光，这归因于其杂质特性。同样原因，Marku和Chatzhitheodoridis无法分辨彩色和回收PE颗粒中PE的拉曼谱带。Liu等人在报告由不同聚合物制成的彩色中微塑料的拉曼光谱时，也检测到了来自颜料的高背景信号，且干扰严重。在与图3相同视场下的高光谱荧光图（见SI中的图S5）显示，相同的PET颗粒具有不同的荧光光谱，这可能与微塑料上的染料或杂质有关。尽管如此，由于我们的FT-HSM具有分离拉曼和荧光光谱的能力，仍然能够分辨出PET的拉曼光谱，证实了该设备即使在微塑料受到强荧光材料污染时，也能识别微塑料聚合物的能力。
即使使用低光谱分辨率扫描，也能在CaCO_3颗粒中清晰检测到PET瓶微塑料（见SI中的图S1）。这证实了我们在商用微塑料测试中发现的优势，即加快测量速度且不降低空间分辨率，有助于在环境样品中快速有效地检测小尺寸微塑料。FT-HSM的这一独特特性至关重要，因为为了进行充分的环境评估，需要检测大量样品。PET瓶微塑料样品的图谱（图3b）也证实了该仪器能够检测小于20μm的微塑料，而这是μ-FTIR平台无法识别的，此前通过检测PMMA和PS微珠（图2g，h）已验证了这一能力。
基于对PET瓶微塑料的分析结果，我们认为拉曼傅里叶变换高光谱显微镜是一种很有前景的方法，可用于直接识别海滩沙子样品中的微塑料，还能够对较小的碎片进行表征，这些小碎片在密度分离后的目视筛选过程中很可能被忽略。此外，我们展示了根据具体问题调整采集参数的能力（例如，初步筛选以快速识别塑料与非塑料材料，或精确研究微塑料的光谱特征），确保在任何情况下结果的有效性（即微塑料识别）。
在本研究中，我们发现基于纤维素的滤膜（即CA和MCE滤膜）的拉曼峰比尼龙滤膜弱（见SI中的图S2），这与Piarulli等人通过近红外高光谱成像检测消化组织中的微塑料时观察到的结果相反。因此，在选择最合适的滤膜材料时，还需要考虑具体的光谱技术。Piarulli等人强调，由于材料本身的不同特性，纤维素滤膜在过滤后颗粒聚集较少，能够保持微塑料的原始大小和形状，相比尼龙滤膜更具优势。这是选择滤膜类型时应考虑的另一个因素，因为它会影响后续对颗粒的表征。此外，比较CA和MCE滤膜的拉曼光谱（见SI中的图S2）可以明显看出，对于我们的拉曼傅里叶变换高光谱显微镜系统，MCE滤膜是测量微塑料的最佳选择。基于这一考虑，我们在过滤掺入微塑料的海水样品（微塑料混合物）后，使用MCE滤膜检测微塑料。
图4展示了微塑料混合物样品的表征结果，根据其特征拉曼峰，清晰地识别出了由PP和PET制成的微塑料，并将它们与MCE背景区分开来，尽管PET微塑料光谱在1292cm^-1处的峰与MCE滤膜的峰相同。图S7展示了对未掺入微塑料的海水样品（即空白样品）进行真空过滤后得到的滤膜的测量结果：在采集的视场中，我们得到了MCE的均匀拉曼特征，这表明不存在任何外来颗粒，也就排除了可能的外部或交叉污染。
尽管MCE滤膜被认为是本次分析的最佳选择，但在解释微塑料光谱时，仍需考虑可能出现的这个额外峰。PP光谱在844cm^-1处的拉曼谱带被认为是基于铬酸盐颜料的特征峰，这再次表明在我们的仪器中，峰值的解释不会受到与染料添加剂相关的荧光背景的干扰，因为在测量阶段，荧光的任何光谱特征都会自动去除。未着色的商用PP中不存在这个特定峰（图2），这支持了上述解释。然而，我们不能排除844cm^-1处的拉曼谱带实际上与聚合物相关，它可能是间同立构PP与高度结晶的等规PP相比，无定形结构的诊断峰。实际上，由于塑料聚合物基本结构的构型和构象变化（即结晶或无定形状态以及反式或扭曲排列），特定塑料聚合物的诊断峰在强度、宽度或位置上也可能会有所不同。
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来源：凯视迈精密测量