摘要：南方医科大学魏小翠和白晓春团队提出了一种通过生骨节中间体将人类扩增多能干细胞（hEPSC）分化为软骨类器官的稳健有效的方案，为探索软骨肥大机制和测试软骨再生的治疗策略提供了一个实用的平台。

人类软骨器官型模型的开发为软骨生成和软骨细胞肥大提供了重要的见解，同时使其在药物发现、基因编辑和组织再生方面具有先进的应用。

南方医科大学魏小翠和白晓春团队提出了一种通过生骨节中间体将人类扩增多能干细胞（hEPSC）分化为软骨类器官的稳健有效的方案，为探索软骨肥大机制和测试软骨再生的治疗策略提供了一个实用的平台。

文章介绍

题目：A Cartilaginous Organoid System Derived From Human Expanded Pluripotent Stem Cells (hEPSCs)

期刊：Bio-Protocol

影响因子：1.0

发表日期：2025年5月

#1

研究背景

Background

由于软骨组织的再生能力有限以及软骨形成和软骨细胞肥大的复杂生物学基础，软骨修复和再生仍然是再生医学中的重大挑战。源自人类多能干细胞（hPSC）的类器官模型为推进软骨研究提供了一种有前景的方法。

存在几种生成hPSC衍生软骨的方案，包括基于中胚层或硬核诱导的分化方案，但这些方案往往缺乏3D结构的复杂性，也没有完全概括肥大成熟阶段。因此，本研究提出了一种可重复的、有效的方法，用于将hEPSC分化为肥大软骨细胞。

#2

研究思路

Methods

该方案包括6天的生骨节诱导，和6周多的3D软骨生成培养随后由骨形态发生蛋白-4（BMP4）、甲状腺激素（T3）和β-甘油磷酸诱导肥大成熟。然后对成熟过程中各种化合物对肥大分化的影响进行敏感性测试。

#3

实验设计

Design

图1 通过生骨节中间体从hEPSC中产生肥大软骨细胞。工作流程包括人胚胎干细胞分化的制备，生骨节诱导，软骨细胞诱导，肥大软骨细胞诱导和化合物测试。

实验步骤

A. 人胚胎干细胞分化的制备

将饲养细胞（7×10^5个细胞/孔）置于明胶包被的6孔板上，置于2 mL/孔的SNL 76/7 STO喂食器中，直至达到汇合。将hEPSC以1.2×10^4个细胞/孔的接种密度接种在hEPSC传代培养基中的汇合饲养层上。24小时后将培养基更换为hEPSCM用于细胞扩增，并每天补充。

制备细胞系用于在约80%汇合时分化。传代细胞两次，以确保完全去除饲养细胞。

对于每次传代，吸出hEPSC培养基（hEPSCM），用1 mL/孔的PBS洗涤细胞一次，并在37℃和5%CO2下用1 mL/孔的室温0.05%胰蛋白酶/EDTA孵育1-2 min以解离饲养细胞。

孵育后，轻轻拍打平板。喂食器将首先分离。用胰蛋白酶/EDTA去除解离的饲养细胞。

hEPSC细胞群可能需要额外的孵育时间。加入新鲜的室温0.05%胰蛋白酶/EDTA，并在37°C和5%CO2下孵育1-2 min以解离细胞群。

用2 mL M10中和胰蛋白酶。

细胞以1000×g离心5 min，弃上清，将细胞重悬于新鲜hEPSC亚培养基中。

制备基质胶包被的6孔板，并在37°C和5%CO2下孵育至少1小时。确保板始终保持水合状态。

弃基质胶溶液。将细胞以1:2的比例接种在hEPSC继代培养基中的基质胶包被的6孔板上，确保均匀分布，置于在37°C和5%CO2下孵育。

注：在饲养层去除过程中，以相对高的密度接种hEPSC以确保最佳克隆生长。

次日早上，吸出培养基，每孔用2 mL PBS轻轻洗涤细胞，以去除残留血清。向每个孔中加入2 mL hEPSCM。

当细胞达到约80%汇合度时，按照相同的程序再次传代细胞，以确保完全去除饲养细胞。

B. 生骨节诱导

用1 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA溶解未分化的hEPSC 1-2分钟。用2 mL M10中和胰蛋白酶。用吸管轻轻吸下松动的细胞群，然后将细胞悬浮液转移到单个15 mL锥形试管中。

注意：避免过度移液，以保持细胞群团块。必要时用细胞刮板轻轻刮除松动的细胞群。

在1000×g离心5分钟，弃去上清液，将细胞团块轻轻重悬于含有10 μM Y-27632的新鲜hEPSC亚培养基中。

将细胞悬浮液以1:6的比例稀释到新的涂有基质胶的细胞培养板上，并加入hEPSC亚培养基。将其置于37℃、5%CO2条件下培养。

注意：为促进完全分化，细胞应稀疏地成团接种，以在分化过程中保持单细胞状态。细胞团块是细胞-细胞接触的必要条件，以便在分化方案的第1至第6阶段存活下来

次日早上，吸出培养基，用PBS简单清洗细胞。加入前原条诱导培养基（APSIM）。

注：标记为第 0天（d0）。可以观察到稀疏的圆形细胞簇。

培养24小时后，吸出培养基并用PBS简单清洗细胞。加入轴旁中胚层诱导培养基（PMIM）。

注：标记为d1。

培养24小时后，吸出培养基并用PBS简单清洗细胞。加入早期体节诱导培养基（ECIM）。

注：标记为d2。细胞从细胞簇向外辐射。

培养24小时后，吸出培养基并用PBS简要清洗细胞。加入生骨节诱导培养基（SCLIM）。

注：标记为d3。细胞呈放射状向外生长，并逐渐与邻近的细胞融合。

在生骨节诱导培养基中培养48-72小时，直到细胞完全融合并形成螺旋状结构。每24小时更换一次生骨节诱导培养基。

注：标记为d4-d6。细胞通常在d6时100%汇合并形成螺旋结构（图2）。

图2 肥大软骨细胞分化过程中的细胞形态。（A）生骨节分化期间细胞的明场图像。（B）代表性时间点球体的顶部明场图像。在3D培养过程中代表性时间点的中间代表性荧光（红色）图像。底部，3D培养过程中代表性时间点的代表性荧光（绿色）图像。

C.软骨细胞诱导

用PBS清洗软骨细胞两次以去除悬浮的死细胞。

加入1 mL/孔的室温0.05%胰蛋白酶/EDTA在37℃、5%CO2条件下培养5-8分钟。

用2 mL M10中和胰蛋白酶，小心吹打，将生骨节细胞分离成单个细胞。

在1000×g离心5分钟，去除上清液，将细胞重悬于生骨节诱导培养基+10 μM Y-27632中。

将细胞培养在无粘性的96孔圆底板中，每孔2.5-5×10^5个细胞，加入100 μL/孔生骨节诱导培养基+10 μM Y-27632。

注：调整接种细胞数可形成不同大小的球体。

以300×g离心5分钟。在37℃、5%CO2下培养过夜。

注：离心后，细胞聚集在每个孔的中心。

次日早上，用窄尖吸管小心吸出培养基。每孔加入100 μL早期软骨细胞诱导培养基（ECIM）。培养6天。用新鲜的软骨细胞诱导培养基更换一次培养基。

注：

a. 培养6天后，细胞向中心聚集，形成球形结构。标记为3D-d7。

b. 更换培养基前无需清洗球形体。确保尽可能彻底地移除培养基。

c. 大规模操作时，使用多通道移液器更换培养基。

小心吸出培养基。添加软骨细胞分化培养基1（CDIM1），培养4天。

注意：此阶段无需更换培养基。

小心吸出培养基。加入软骨细胞分化培养基2（CDIM2），培养4天。

注：此阶段无需更换培养基。到这一阶段结束时，球体的大小会明显扩大。标记为3D-d14。

小心吸出培养基。加入软骨细胞成熟培养基（CMM），培养14天。每3天更换一次培养基。

注：在此阶段结束时，球体会出现显著的COL2A1表达。标记为3D-d28。

D. 肥大软骨细胞诱导和化合物测试

诱导肥大软骨细胞：

a．小心吸出3D-d28球形体的培养基，并加入软骨细胞肥大培养基 (CHM)。

b．在软骨细胞肥大培养基中培养14-28天。每3天更换一次培养基。

注：在此阶段，球形体的大小显著增大。培养14天后，球体表现出显著的COL10A1表达。标记为3D-d42。3D-d42的球体大小可达2毫米。

用于测试化合物对肥大分化的影响：

a. 用CHM配制每种化合物。在CHM中加入等量的DMSO作为对照。

b. 小心吸出3D-d28球体中的培养基，然后加入CHM+化合物或CHM+DMSO。每3天更换一次培养基。

c. 至少培养7天后分析标记物的表达（图3）。

注：培养14天后，CHM+1 μM酚妥拉明与CHM+DMSO相比，COL10A1的表达量减少。

图3 免疫荧光和实时定量 PCR (qPCR) 验证了酚妥拉明对软骨细胞肥大的抑制作用。（A）用软骨细胞肥大培养基（对照）和CHM加酚妥拉明处理14天的hEPSC衍生软骨细胞的代表性共聚焦图像，用软骨细胞特异性标记ACAN染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。（B）通过qPCR测量用中药（对照）和中药加酚妥拉明处理14天的颗粒中COL2A1、COL10A1和ACAN的相对mRNA表达。

实验验证

1. 该方案已在以下研究文章中使用并得到验证：

- Wei等人。人体类器官药物筛选确定α2-肾上腺素能受体信号传导是软骨再生的治疗靶点。Cell Stem Cell。

2. 该方案是先前的hiPSC衍生的软骨细胞方案的优化版，该方案在以下研究文章中应用并验证：

- Pretemer等人。从人类iPSC中分化出肥大软骨细胞，用于软骨发育不良的体外建模。Stem Cell Rep。

生物材料

试剂

溶液配制

设备

参考文献

Wang H, Qiu J, Lin Y, Bai X, Wei X. A Cartilaginous Organoid System Derived From Human Expanded Pluripotent Stem Cells (hEPSCs). Bio Protoc. 2025 May 5;15(9):e5304. doi: 10.21769/BioProtoc.5304.

来源：培养盒守护者