摘要：真核生物 mRNA 前体可通过可变剪接 （ alternative splicing ） 生成多种基因异构体（ isoform ），极大地丰富了 转录本和 蛋白质的多样性。 对基因 异构体的精准定量不仅有助于 深入 解析剪接调控机制，也在疾病研究与临床转化中具

真核生物 mRNA 前体可通过可变剪接 （ alternative splicing ） 生成多种基因异构体（ isoform ），极大地丰富了 转录本和 蛋白质的多样性。 对基因 异构体的精准定量不仅有助于 深入 解析剪接调控机制，也在疾病研究与临床转化中具有重要价值。然而，当前 主流 的短读长 RNA 测序技术（如 Illumina ）受限 于读长 ，难以 准确 解析结构复杂 、 外显子 高度 共享 的基因异构体， 容易 导致定量误差。 尽管近年来 PacBio 与 Oxford Nanopore Technologies (ONT) 等长读长 RNA 测序 平台 在 基因 异构体 解析 方面取得显著进展，但其高成本与有限测序深度 仍 制约 了低 丰度 转录本的检测与定量准确性。 因此，实现对基因异构体的精准定量， 仍是该领域亟待解决的核心难题 。

2025 年 6 月 3 日 ，美国密歇根大学 （ University of Michigan ）区健辉（Kin Fai Au）团队在 Nature Biotechnology 在线发表研究论文 Improving gene isoform quantification with miniQuant ，系统实现了新型基因异构体定量工具miniQuant。该工具创新性地引入“广义条件数”（K值）以量化基因异构体结构复杂性与可区分性，进而判别短读长测序中难以准确定量的基因。随后，miniQuant可针对每个基因及其样本特征，自动设计最优策略融合长读长与短读长数据，从而在全基因组范围实现更为准确、稳健的基因异构体定量。

尽管长读长 RNA 测序技术已问世十余年，相关方法学研究仍主要聚焦于基因异构体的识别，而真正专注于异构体 定量 分析的工具仍相对稀缺。 目前 亦 缺乏系统性评估 来回答一个关键问题 ： 长读长测序在 基因异构体 定量中究竟提升了多少 精度 ？哪些基因或场景中提升最 显著 ？ miniQuant 的提出正是为了 填补 这一 领域的 空白。 其 包含两个核心功能：（ 1 ）识别短读长测序难以准确定量的 基因 异构体；（ 2 ） 融 合长、短读长数据，实现对这些复杂 基因 异构体的高精度定量。具体而言，作者首先基于 严谨的 数学推导为每个基因计算一个 广义条件数（ K 值） ，用于 衡量 其结构复杂性与 异构体间的 可区分性。随后， miniQuant 基于 K 值、异构体结构 特征 和测序读长等， 自动 设计最优策略 以 整合长 、 短读长测序数据， 最终 输出准确 、稳健 的 基因 异构体表达量。

研究团队通过模拟数据、 真实 实验数据 以 及公共数据对 miniQuant 进行 了 系统评估，显示其在 定量 准确性和稳定性方面均优于现有主流工具（如 IsoQuant 、 Bambu ）。 进一步地 ， 作者 将 miniQuant 应用于人类胚胎干细胞（ hESC ）向原始生殖细胞样细胞（ PGC ）分化 模型系统 中，基于 基因 异构体使用率 的 差异分析，识别出多个在分化过程中表达显著变化的关键 基因 异构体。

在 机制层面， miniQuant 还揭示 出 基因 异构体定量误差主要源自两个方面：反卷积误差（ deconvolution error ）与抽样误差（ sampling error ）。长读长测序因其 可 覆盖完整转录本，显著 降低了结构复杂（ K 值较大 ） 基因 在 读段 归属上 的 不确定 性，从而 有效降低 反卷积误差。然而， 其受限于 测序深度 使其在检测低表达基因异构体时 更 容 易受抽样误差 的 影响。 相较之下 ，短读长测序 拥 有更高 的测序 深度， 能够 缓解抽样误差，但 在结构复杂基因中， 仍面临读段归属模糊的问题 。 miniQuant 通过 融合 长、短读长测序数据的互补优势 ，在这两类误差之间实现有效权衡，最终 显著 提升 了基因异构体 定量 的 准确性。

与 传统方法 相比 ， miniQuant 不仅 在 基因 异构体定量性能上表现 优异 ，更首次系统性回答了 三个 关键问题： （ 1 ） 哪些基因异构体可以被准确定量？ （ 2 ） 即便在长读长测序下，哪些 基因 异构体仍难以 定量 ？ （ 3 ） 长读长数据在定量上具体带来了哪些层面的提升 ？ 本研究为利用长读长测序开展基因异构体研究提供了全新范式 。 miniQuant 不仅可为生物学研究者提供 “ 定量可置信度 ” 基因列表，明确指出哪些 基因 异构体表达量具有较高可靠性、哪些需谨慎解读； 还为实验设计提供了实用参考，包括：如何选择 PacBio 或 ONT 测序 平台？采用 cDNA 测序 还是 直接 RNA 测序 策略？如何优化长 、 短读长测序的深度配比以实现最佳性价比？

本研究由美国密歇根大学区健辉教授担任通讯作者，李浩然博士 研究生 、王定杰博士、高琦博士、谭普文博士、王运浩博士和蔡晓 羽 博士为共同第一作者。 目前， miniQuant 已在 GitHub 开源（ https://github.com/Augroup/miniQuant ），欢迎有下载使用与反馈建议。

制版人： 十一

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来源：小黄的科学讲堂