摘要：活体肿瘤细胞疫苗（TCV）在癌症免疫治疗方面显示出了希望。微针阵列提供了一种工具，通过无痛的皮内注射方式提高疫苗的免疫反应。然而，使用微针阵列进行活体TCV的皮内递送仍然面临巨大的挑战。

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活体肿瘤细胞疫苗（TCV）在癌症免疫治疗方面显示出了希望。微针阵列提供了一种工具，通过无痛的皮内注射方式提高疫苗的免疫反应。然而，使用微针阵列进行活体TCV的皮内递送仍然面临巨大的挑战。

来自四川大学的苟马玲团队开发了一种冰微针阵列递送活体TCV的方法，这种方法能够持续分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），可用于癌症治疗。这种冰微针阵列由冰微针和一个匹配的聚合物支架组成，它们通过静态光学投影光刻（SOPL）技术定制制造。活体TCV由经过辐射处理并转染了纳米颗粒介导的GM-CSF质粒的黑色素瘤细胞组成。在通过冷冻保存过程轻松加载到冰微针后，活体TCV可以通过微针装置高效地递送到真皮层。与皮下注射相比，皮内给药在接种部位招募了更多的树突状细胞，并增加了肿瘤中CD8+ T细胞的浸润。冰微针阵列递送的皮内TCV显著抑制了黑色素瘤的生长，并有效地防止了黑色素瘤的复发，而且没有明显的副作用。这项工作展示了一种有前景的黑色素瘤治疗方法，这将激励未来的癌症免疫治疗研究。相关工作以题为“Intradermal Delivery of Cell Vaccine via Ice Microneedles for Cancer Treatment”的文章发表在2024年11月05日的期刊《Advanced Healthcare Materials》。

1.创新型研究内容

本文利用SOPL技术快速制造了定制的冰微针（ice MNs）。这种冰微针能够皮内递送活体肿瘤细胞疫苗（TCVs），并保持其活性。为了进一步增强活体TCV的免疫原性，本文通过一种有效的非病毒基因递送系统对其进行了修饰，使其表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（图1）。与皮下接种相比，皮内给药在接种部位的真皮层招募了更多的树突状细胞，并引发了肿瘤微环境中CD8+ T细胞浸润的增加。此外，冰微针递送的TCVs显著抑制了黑色素瘤模型中的肿瘤生长，并防止了肿瘤复发。这种用于皮内递送TCVs的冰微针装置展示了一种有前景的策略，能够激发有效的抗癌免疫反应。

图1 冰微针（MNs）用于将修饰过的全肿瘤细胞疫苗（TCV）递送到真皮层的示意图

【冰微针的定制制造与表征】

冰微针是通过微模塑技术制造的。借助SOPL技术，主模具在3秒内设计和生产完成，大大加快了制造过程。这种灵活且可控的方法使得可以创建各种形状的定制冰微针贴片，包括环形、圆形和五角星形（图2A）。通过数字光处理（DLP）3D打印技术制造了一个树脂材料的支架，与模具精确匹配，并在冻结后易于脱模。在这个支架的底部，均匀分布有直径400微米、高度400微米的空心圆柱体，作为与针头的紧密连接（图2B）。冰微针贴片具有13×13的阵列，针尖之间的距离为1毫米，尖端的高度约为900微米，宽度为400微米（图2C,D）。因此，3D打印技术为快速制造定制冰微针提供了一种先进的方法。

图2 冰微针（MNs）的定制制造

本文研究了冰微针在室温和体温下的稳定性。从-80℃取出后，冰微针的尖端出现霜冻，并保持其形状长达120秒（图3A）。当贴片轻轻放置在人的手臂皮肤上时，它迅速融化（图3B）。冰微针阵列的机械性能是决定其穿透能力的关键因素。进行了压缩测试以研究阵列的机械强度，结果表明不同冰微针在压缩后没有显著断裂（图3C）。与负载B16-F10细胞的冰微针相比，仅含有PBS或低温培养基的微针表现出略高的抗压能力。PBS和低温培养基组的最大抗压力平均为0.4 N/针，而细胞负载组为0.38 N/针，超过了皮肤穿透的要求。此外，将含有罗丹明B溶液的冰微针贴片插入到一只6周龄小鼠的侧腹皮肤中，以检测其是否能够到达真皮层。孔洞和罗丹明B信号证明了皮肤穿透（图3D）。平均穿透深度测量范围为300–500微米（图3E），达到真皮层。此外，使用载有Cy-5标记的B16-F10细胞的冰微针进行的实验证实，贴片可以将细胞输送到真皮层（图3F）。经过冰微针处理后，与贴片形状匹配的可见微孔阵列在皮肤表面快速愈合，在3分钟内恢复（图3G）。

图3 冰微针（MNs）的表征

【活性TCV的制备与表征】

B16-F10和B16-F10-luc细胞接受了亚致死剂量的X射线（100戈瑞）照射，以达到肿瘤细胞失活的效果。通过体外和体内细胞增殖实验来评估照射后细胞的致癌潜力。如图4A和4B所示，将经过照射的B16-F10-luc细胞皮下注射到小鼠侧腹，以监测它们在体内的存活和增殖情况。植入后四天，与第0天相比，荧光强度显著下降了77%至97%。注射后18天，小鼠体内的荧光完全消失。此外，将照射过的细胞种植在96孔板中，并分别在24小时、48小时和72小时后进行监测。如图4C所示，与未照射的B16-F10细胞相比，照射后的细胞失去了增殖能力，同时保持了形态完整性。总的来说，本文结果表明，照射后的肿瘤细胞失去了它们的致癌潜力。

图4 活体肿瘤细胞疫苗（TCV）的表征

【冰微针疫苗在体内的抗肿瘤免疫效果】

为评估冰微针（ice MNs）传递的活体肿瘤细胞疫苗（living TCV）在体内的治疗效果，本文通过将5 × 105个B16-F10细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右侧腹股沟建立了黑色素瘤模型。如图5A所示，在第3天、第6天和第9天分别通过皮下注射（每剂量4 × 105个细胞）或冰微针疫苗（每剂量2贴，每贴含有2 × 105个细胞）给予三剂疫苗。与其他组相比，冰微针组显示出显著的肿瘤负担减少（图5B）。冰微针组的平均肿瘤重量为0.36 ± 0.23克，皮下疫苗组为0.92 ± 0.20克，对照组为1.33 ± 0.27克（图5C）。与皮下治疗组和对照组相比，接受冰微针疫苗接种的小鼠肿瘤体积增长趋势较慢（图5D–G），这表明通过冰微针进行皮内递送疫苗可以诱导更强的抗肿瘤效果。此外，各组小鼠在治疗期间体重保持稳定（图5H），表明冰微针疫苗在体内的安全性。

图5 冰微针（MNs）疫苗在体内的抗肿瘤免疫反应

【冰微针疫苗的预防性肿瘤免疫治疗在体内】

为进一步研究冰微针疫苗在免疫治疗中的预防潜力，本文建立了黑色素瘤模型。实验流程如图6A所示。如图6B所示，接受冰微针疫苗治疗的小鼠与其他组相比，生存时间显著延长。到第40天时，冰微针疫苗组有一只小鼠仍然存活，而其他组的所有小鼠都已被安乐死。同样，与皮下疫苗和对照组相比，冰微针疫苗治疗对肿瘤生长的抑制效果更为显著（图6C–F）。此外，实验期间各组小鼠的体重保持稳定，表明治疗的副作用有限（图6G）。同时，在治疗小鼠的脾脏中检测到了记忆T细胞。与皮下组相比，微针治疗组的效应记忆CD4+ T细胞（CD4+ Tem, 26% ± 3.4%，p = 0.004）和CD8+ T细胞（CD8+ Tem, 6.5% ± 2.1%，p = 0.001）显著增加。对于中央记忆CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，也观察到在冰微针（CD4+ Tcm, 9.1% ± 2.8%；CD8+ Tcm, 6.5% ± 2.1%）和皮下组（CD4+ Tcm, 7.8% ± 1.6%，p = 0.460；CD8+ Tcm, 3.9% ± 0.8%，p = 0.137）中百分比增加（图6H-N）。此外，收集主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行H&E染色分析。未观察到显著损伤，证实了本文治疗的安全性。这些结果表明，本文的冰微针疫苗可以提供一种有效且安全的预防肿瘤生长的方法。

图6 冰微针（MNs）疫苗在体内的预防性肿瘤免疫治疗

2.总结与展望

总之，本文开发了一种包含修饰过的TCVs的冰微针（ice MN）装置，用于在真皮层中持续释放佐剂以治疗癌症。本研究表明，冰微针疫苗是安全且易于使用的，它在体外和体内都引发了强烈的CD8+ T细胞免疫反应。与皮下接种相比，皮内递送的冰微针疫苗对黑色素瘤产生了强效、持久且有效的反应。未来，这种新颖的冰微针疫苗有望提供一种有效且个性化的癌症治疗策略。

来源：EngineeringForLife一点号