摘要：铜死亡是一种最近发现的，由细胞内铜离子积累引发的细胞程序性死亡。其中铜离子通过直接结合细胞三羧酸循环（TCA）过程的脂酰化组分，导致蛋白毒性应激和最终的程序性免疫原性细胞死亡（ICD）。因此，癌细胞中诱导铜死亡成为了一种有潜力的治疗方法。然而，以往的相关疗法面

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文章背景

铜死亡是一种最近发现的，由细胞内铜离子积累引发的细胞程序性死亡。其中铜离子通过直接结合细胞三羧酸循环（TCA）过程的脂酰化组分，导致蛋白毒性应激和最终的程序性免疫原性细胞死亡（ICD）。因此，癌细胞中诱导铜死亡成为了一种有潜力的治疗方法。然而，以往的相关疗法面临着敏感性低、存在耐药性及体内清除快等弊端，使得铜死亡抑制癌细胞的效果大打折扣，亟需研发新的疗法。

为了解决突破这一瓶颈，来自南京大学生命分析化学国家重点实验室的宋玉君/孔德圣团队于2024年10月在《Advanced Functional Materials》上发表了题为“Microneedle-Loaded Gene-Editable Nanohybrids Engineer Cancer Cells by Telomere Stress Induction and Metabolic Interference for Enhanced Cuproptosis and Immunotherapy”的研究，创新性地开发了一种携带无载体纳米复合物的新型微针。这种可溶性微针能够负载并靶向递送铜离子、端粒靶向药物6-Thio-dG及CRISPR/Cas9系统，实现癌细胞免疫微环境重编程和癌细胞铜死亡增敏，为基于铜死亡的癌症治疗提供了新的解决方案。

本篇文章的思路在于，围绕癌细胞铜死亡疗法中的铜离子蓄积和增敏问题，构建了负载CuTG-Cas9@PLL的可溶性微针（MN），研究了其制备表征、体外增敏机制和体内应用。其中重点关注了：（1）端粒应激诱导和CRISPR/Cas9介导的肿瘤特异性代谢干扰增敏铜死亡（2）基于铜死亡ICD、癌细胞衰老和抑制糖酵解实现的微环境免疫原性重编程

接下来就让我们一起学习一下这篇论文吧。

图1 用于治疗的CuTG-Cas9@PLL MNs贴剂的制备图

研究结果

一、CuTG-Cas9@PLL的制备与表征

1、制备、形貌与结构表征：作者通过多步合成策略制备CuTG-Cas9@PLL，并利用透射电子显微镜（TEM）和高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）观察了CuTG-Cas9@PLL的形态和元素分布（图2A，B）。进一步的，利用Zeta电位验证了CuTG上的一系列修饰，包括负载CRISPR/Cas9 RNP和PLL涂层（图2C）。

2、铜离子的响应性释放性能：由于铜和GSH之间的螯合作用，GSH能诱导CuTG-Cas9@PLL分解。在pH=7.4、GSH浓度=1或10 mg/mL的环境下，TEM下观察到CuTG和CuTG-Cas9@PLL的分解（图2E），并检测到上清液中铜离子的持续释放（图2F）。进一步的，在pH=7.4或5，GSH浓度=1或10 mg/mL的环境下孵育，观察到上清液中的铜离子随着CuTG或CuTG-Cas9@PLL浓度的增加而增加（图2G）。

3、CRISPR/Cas9 RNP的响应性释放性能：接下来作者利用FITC标记的Cas9蛋白，在pH=7.4或5的GSH处理组中，上清液的荧光显示出随时间的梯度增加（图2H）。GSH与CuTG-Cas9@PLL共同孵育后，表现出随时间和GSH浓度增加而消耗的行为（图2I，J）。

在本部分，作者成功制备并表征了CuTG-Cas9@PLL纳米复合物。由于BSA和聚-L-赖氨酸（PLL）涂层的存在，能够保护Cas9免于降解，并通过表面阳离子增强细胞摄取。作者还验证了CuTG-Cas9@PLL关键的GSH响应性释放性能，使其具有针对癌细胞的靶向和释放潜力。

图2 CuTG-Cas9@PLL的顺序制备与表征

接下来，作者就在体外重点研究了两种增敏铜死亡机制的可行性。

二、CRISPR/Cas9介导的代谢程序化致敏铜死亡

1、内化与入核：通过CLSM成像在B16F10细胞中观察FITC标记的CuTG-Cas9@PLL，其在细胞内随孵育时间（0、2、4、6和8小时）积累而增加，且在6小时后观察到细胞核中出现（图3A，B）。

2、检测基因编辑效率：利用T7核酸内切酶I（T7 E1）测定发现，CuTG-Cas9@PLL处理后B16 F10细胞的基因组DNA表现出20.5%的突变频率，而其他组中几乎没有观察到突变（图3C）。桑格测序结果也证明了CuTG-Cas9@PLL在乳酸脱氢酶（LDHA）基因座处出现多个峰，表明成功进行了基因编辑和突变（图3D）。

3、验证糖酵解抑制：WB结果所示，CuTG-Cas9@PLL处理组的LDHA蛋白水平低于其他组（图3E）。同时在24和48小时检测到CuTG-Cas9@PLL处理组中的乳酸含量显著降低（图3F）。

以往的文献表明，线粒体呼吸依赖性细胞对铜离子载体的敏感性是糖酵解呼吸依赖性细胞的1000倍。抑制糖酵解会诱导代谢向三羧酸循环（TCA）转变，并进一步使细胞对铜死亡敏感。因此，作者进一步验证了CuTG-Cas9@PLL抑制糖酵解途径后，是否发生铜死亡水平上调，以及产生更大的细胞毒性。

4、检测铜死亡标志性指标：WB结果证明了CuTG-Cas9@PLL诱导的DLAT（三羧酸循环中的关键酶组分）寡聚化，而利用铜死亡抑制剂四硫代钼酸盐（TTM）则逆转了这一作用（图3G）。免疫荧光染色证明了DLAT寡聚化信号在CuTG-Cas9@PLL处理组中最强，且随着TTM的增加而减弱（图3H）。

5、验证细胞毒性：CCK-8结果证明，CuTG@PLL对细胞毒性呈剂量依赖性，且TTM能够逆转这一过程（图3I）。CuTG-Cas9@PLL和携带草氨酸钠（Oxa）（一种特异性LDHA抑制剂）的CuTG@PLL对细胞表现出比CuTG@PLL本身显著更大的毒性（图3J）。流式细胞仪分析也表明，CuTG-Cas9@PLL处理组中的细胞毒性最高（图3K）。

在本部分，作者验证了CuTG-Cas9@PLL的成功内化和CRISPR/Cas9 RNP的核递送，并证实了基于CRISPR/Cas9的LDHA敲除，成功重塑了B16 F10细胞的能量代谢。作者进一步验证了CuTG诱导的铜死亡发生，以及通过糖酵解抑制能够对铜死亡的起到增敏作用。

图3 CuTG-Cas9@PLL介导的LDHA沉默对致敏铜死亡的影响

三、6-Thio-dG介导的端粒应激增敏铜死亡

癌细胞的“排毒”机制，包括活跃的自噬和强大的溶酶体降解功能，可以提供对铜死亡的强大抵抗力，帮助癌细胞存活。因此，通过治疗诱导癌细胞衰老，破坏其“排毒”机制，可以增强铜死亡治疗的有效性。6-Thio-dG作为一种独特的肿瘤靶向药物，可以选择性地进入具有阳性端粒酶活性的癌细胞端粒中，并破坏端粒的结构和功能，导致细胞衰老或死亡（图4A）。

1、验证端粒应激：免疫荧光染色结果显示，CuTG@PLL和6-Thio-dG处理的细胞中，绿色的-H2AX信号显著上调（图4B）。通过端粒功能障碍病灶（TIF）实验，检测共定位的端粒（红色）和CuTG-Cas9@PLL（绿色）信号发现，TIF信号随CuTG@PLL或CuTG-Cas9@PLL的处理表现出剂量依赖性增加，与6-Thio-dG处理组一致（图4C）。

2、验证细胞衰老：CuTG-Cas9@PLL处理的细胞表现出显著增加的β-半乳糖苷酶活性（图4D）。

在此处，作者已经证明CuTG-Cas9@PLL能够引起端粒应激，并导致细胞衰老。然而，这二者之间是否有直接联系？其中关键组分——6-Thio-dG是如何影响细胞衰老的发生？作者进一步探究了二者之间的机制。

3、探究6-Thio-dG引起细胞衰老的机制：用不同浓度的6-Thio-dG处理而不添加Cu-Elesclomol（一种小分子铜离子载体）时，DLAT寡聚化信号随着6-Thio-dG浓度的增加而增加。而对于额外加入Cu-Elesclomol处理的细胞，6-Thio-dG处理后也具有类似的增加趋势。（图4F、G）。

根据以往的研究显示，衰老细胞普遍存在细胞内pH升高和溶酶体pH降低，导致溶酶体功能受损和自噬降解抑制的过程。其中自噬活性标志物SQSTM 1/p62、LC 3B-II/LC 3B-I的表达水平与自噬活性呈密切相关（图4E）。那么，6-Thio-dG是否是通过影响自噬流而引起细胞衰老？为了验证这一猜想，作者进一步探究了6-Thio-dG对自噬流的影响。

4、探究6-Thio-dG对自噬流的影响： B16 F10细胞的p62水平随着Cu-Elesclomol浓度的增加而逐渐降低，表明自噬流激活。而随着6-Thio-dG的加入，p62水平又重新升高（图4H，I）。LC3B的WB结果也显示，6-Thio-dG处理组中LC 3B-II/LC 3B-I的比率增加（图4J）。

在本部分，CuTG-Cas9@PLL处理后的细胞中表现出强烈的DNA损伤，成功诱导了端粒应激，这证明了其诱导癌细胞衰老的能力。由于铜沉积已被鉴定为衰老细胞的普遍特征，作者证明了6-ThiodG增强的DLAT寡聚化和铜累积可能归因于衰老细胞中自噬流受阻，自体溶酶体降解过程异常，导致铜离子积累和更多DLAT寡聚化形成，并在细胞中积累。

图4 CuTG-Cas9@PLL介导的端粒应激用于铜死亡增敏

四、经皮给药的微针贴片制备

1、微针制备与表征：由于磺丁基醚-环糊精（SCD）具有强大的机械强度和低粘度特性，将其作为整合CuTG-Cas9@PLL的微针（MN）基质，用于精确有效的药物递送和体内黑色素瘤治疗（图5A）。扫描电子显微镜（SEM）图像和光学图像显示，SCDMN显示直径为11 mm，针的高度和基部直径分别为1000 μm和600 μm（图5B，C）。

2、微针的药物负载与释放：为了可视化药物分布和释放，分别使用罗丹明B（RhB）和CuTG-BSA-FITC@PLL来分别模拟小分子药物（6-Thio-dG）和纳米材料（CuTG@PLL和CuTGCas9@PLL）。在荧光显微镜下，可以观察到RhB和CuTG-BSA-FITC@PLL在微针中均匀分布（图5D），且均在30秒内能够完全释放到PBS中（图5E）。

3、微针的机械强度测试：单纯的微针、负载RhB的微针和负载CuTG-Cas9@ PLL的微针的力-位移曲线均是平滑连续的，各组单针的力分别为0.33、0.3和0.25 N，足以刺穿皮肤的角质层（图5F）。进一步在小鼠皮肤上测试负载CuTG-Cas9 @PLL的SCD MN的体内皮肤插入能力，可见其皮肤表面显示出完整的针孔阵列（图5G）。

4、微针的体内药物释放及递送性能：光学图像显示，微针在插入小鼠皮肤5分钟和10分钟后分别溶解了约50%和100%（图5I）。3D重建图像显示，在不同深度检测RhB和FITC荧光成像，可见药物能够递送至皮肤的指定深度（图5J，K）

在本部分，作者证明成功制备了微针并负载了CuTG-Cas9@PLL。微针能够在小鼠体内释放，且能够刺穿小鼠皮肤的角质层实现约200-300 μm的穿透深度，可以证明微针具有良好的载药、释放及机械性能。

图5 微针贴片的制备和表征

五、CuTG-Cas9@PLL MN微针用于小鼠体内治疗

基于第四部分中微针良好的性能，作者探索了CuTG-Cas9@PLL MN在皮下接种了B16 F10黑色素瘤细胞的C57 BL/6小鼠中的体内抗肿瘤作用。将20只小鼠均匀随机分为四组：PBS、6-Thio-dG、CuTG@PLL和CuTG-Cas9@PLL，每天分别将无负载、6-Thio-dG、CuTG@PLL和CuTG-Cas9@PLL负载的SCD MN施用到肿瘤部位中，持续14天，以实现持续施用（图6A）。

1、监测肿瘤体积和小鼠体重：负载CuTG-Cas9@PLL MN的处理组对肿瘤生长抑制表现出明显更强的作用（图6B-D），但并未对四组小鼠的体重产生明显的影响（图6E）。

2、检测体内基因编辑效率：与第二部分类似，通过T7 EI检测并量化了黑色素瘤的体内基因编辑效率，可见CuTG-Cas9@PLL MN处理组的插入缺失频率为17.8%。桑格测序结果进一步证实了LDHA基因座处的成功基因编辑（图6F，G）。针对LDHA表达的肿瘤组织的免疫荧光染色也证明CRISPR-Cas9对于体内LDHA的成功敲除（图6H）。

3、检测体内铜死亡和抗肿瘤效果：免疫荧光染色显示，在CuTG@PLL和CuTG-Cas9@PLL的MN处理组中，DLAT的荧光信号显著增强（图6I）。Ki67、TUNEL染色和苏木精&伊红（H&E）染色结果也证实了CuTG-Cas9@PLL MN良好的抗肿瘤效果（图6J）。

在本部分，作者成功证明了CuTG-Cas9@PLL MN在小鼠体内的基因编辑、诱导铜死亡和抗肿瘤能力。行文至此，作者已经相对完整地讲述了一个，由临床问题出发自上而下构建的经微针递送的纳米复合物，基于铜死亡及两种增敏机制起到优异抗肿瘤效果的故事。是否可以在此收尾了呢？

以往的研究表明，铜死亡最终将导致蛋白毒性应激和最终的程序性免疫原性细胞死亡（ICD）。而通过治疗诱导癌细胞衰老，及CRISPR/Cas9抑制癌细胞糖酵解途径，也会对癌细胞内的免疫微环境产生很大影响。因此，作者进一步思考，CuTG-Cas9@PLL MN是否会在体内引起抗肿瘤免疫激活作用，引起免疫抑制肿瘤微环境（TME）重编程？

图6 CuTG-Cas9@PLL 微针贴片的体内抗肿瘤作用

六、CuTG-Cas9@PLL的体内免疫应答

1、检测小鼠脾脏中免疫细胞变化：流式细胞仪检测显示，6-Thio-dG添加和CRISPR/Cas9介导的LDHA敲除显著促进了树突状细胞（DC）成熟（图7B），活化的细胞毒性CD8+和CD4+ T细胞的比例均显著增加（图7C），肿瘤免疫抑制性Treg细胞（CD4+，Foxp 3+）的比例在治疗后降低（图7D），且肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的M2型极化减少和M1型极化增加（图7E）。

2、检测小鼠肿瘤组织中免疫细胞变化：肿瘤切片的免疫荧光图像进一步证实，实体瘤组织中CD8+ T细胞浸润显著增加，而Treg细胞浸润减少（图7F）。

3、检测小鼠外周血中细胞因子变化：小鼠血清中检测显示，白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-β（TNF-α）和干扰素-β（IFN-β）的水平在CuTG-Cas9@PLL治疗后显著高于其他组（图7G-I）。

在本部分，作者证明了CuTG-Cas9@PLL在恶性黑色素瘤小鼠体内引起TME重编程，进一步有力地起到了抗肿瘤作用。作者认为以上结果可以归因于：（1）6-Thio-dG处理引起的端粒相关损伤和铜死亡导致的损伤相关分子模式（DAMP）释放可能促进了DC的成熟；（2）衰老的癌细胞具有强免疫原性，其中ICD可以引发由DC和CD 8 + T细胞介导的强抗肿瘤效应；（3）CRISPR/Cas9介导的LDHA敲除，可以促进基于铜累积引起的ICD，以增强DC的激活和M1巨噬细胞表型极化；（4）乳酸减少能够缓解TME酸化，逆转免疫抑制作用，促进巨噬细胞从M2型向M1型极化，降低主要依赖乳酸提供能量的Treg细胞比例。

图7 体内免疫应答激活的评估

总结与展望

本研究成功开发了一种可溶性微针（MN）搭载自组装CuTG-Cas9@PLL纳米化合物，用于肿瘤细胞中增强铜死亡致敏的抗肿瘤免疫疗法。这种新型递送策略在克服了小分子药物6-Thio-dG的快速清除和肿瘤蓄积差缺点的同时，通过CRISPR/Cas9介导的代谢干扰和6-Thio-dG诱导的端粒应激，协同作用于肿瘤细胞中诱导增强铜死亡，并进一步逆转免疫抑制肿瘤微环境，获得协同增强的抗肿瘤免疫应答。

本研究首次实现了CRISPR/Cas9系统介导的代谢干扰在肿瘤细胞对铜死亡增敏方面的成功，也是第一次证明端粒应激和细胞衰老诱导的自噬障碍在促进癌症治疗的铜死亡方面具有显著的积极作用。这一策略为后续基于铜死亡癌细胞治疗增敏提供了强而有力的治疗选择，为降低各种治疗的耐药性提供了全新的见解。

来源：EngineeringForLife一点号