摘要：Tau蛋白（微管相关蛋白Tau，MAPT）是维持神经元胞内微管稳定性和动态平衡的关键蛋白。它在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）、额颞叶痴呆（FTD）等神经退行性疾病中发生病理性异常聚集，形成神经原纤维缠结（NFTs），是tauop

引言

Tau蛋白（微管相关蛋白Tau，MAPT）是维持神经元胞内微管稳定性和动态平衡的关键蛋白。它在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）、额颞叶痴呆（FTD）等神经退行性疾病中发生病理性异常聚集，形成神经原纤维缠结（NFTs），是tauopathy类疾病的主要标志之一。

在人脑中，Tau存在六种剪接变体，Tau441（2N4R Tau）是其中最长的亚型，包含441个氨基酸，具有两个N端插入片段和四个微管结合结构域。Tau441广泛用于神经病理机制研究、蛋白聚集模型构建、药物筛选平台建立等方向。

通过重组表达获得结构完整、功能稳定的Tau441蛋白，是科研工作者在神经退行性疾病领域进行基础与转化研究的重要技术手段。

Tau441蛋白的结构与功能特性

Tau441全长441个氨基酸，分子量约为45–46 kDa。其结构分为以下几个关键区域：

N端投射区（1–150 aa）：包含N1和N2插入片段，参与调节Tau与其他蛋白或细胞骨架成分的互作。

中段亲微管区（~200–370 aa）：包含四个微管结合重复序列（R1–R4），是Tau稳定微管的重要结构基础。

C端区域（370–441 aa）：在病理聚集过程中可能形成β折叠结构，参与神经原纤维的形成。

Tau属于天然无序蛋白（Intrinsically Disordered Protein, IDP），其柔性结构使其易受环境因素（如磷酸化、氧化应激、诱导剂等）影响发生构象变化，从而导致寡聚体或纤维状聚集体的形成。

重组表达系统介绍

Tau441的表达系统选择依据实验需求、产量目标及翻译后修饰需求，主要包括以下几种：

1. 原核表达系统（大肠杆菌）

最常用的表达平台，代表菌株如E. coli BL21(DE3)。其优势在于：

表达效率高，适合大规模制备

成本低，操作简便

可用于构建聚集体、PFFs等聚集模型

但该系统不具备翻译后修饰功能，如Tau蛋白在疾病状态下常见的磷酸化或乙酰化。

2. 哺乳动物细胞系统（HEK293、CHO）

适用于需要天然构象及磷酸化修饰的研究：

支持原位表达和组分间互作研究

可用于开发抗体、筛选激酶调控通路

哺乳动物细胞表达的Tau441重组蛋白适合高级别功能研究或临床前验证。

3. 酵母/昆虫细胞系统（如Sf9）

提供较好的翻译后修饰支持，表达量高于哺乳动物系统，常作为折中选择。适用于特定修饰状态的Tau蛋白制备。

纯化流程介绍

根据表达系统不同，Tau441的纯化流程略有差异，但核心步骤包括以下几个方面：

1. 标签选择与初步纯化

常用6×His、GST、MBP等融合标签，以提高可溶性并简化纯化流程

通过Ni-NTA亲和层析（His-tag）或Glutathione Sepharose（GST-tag）进行初步纯化

2. 脱标签及高级纯化

使用TEV或Thrombin酶切去除标签

离子交换层析（如Q-Sepharose）进一步去除杂蛋白

凝胶过滤（SEC）分离聚集体与单体形式，获得构象均一的样品

鉴定与质检分析

Tau441纯化后需要通过多维度手段确认其纯度、构象状态与功能活性：

1. 纯度与分子量确认

SDS-PAGE：快速评估纯度和蛋白大小

Western blot：使用抗Tau抗体（如Tau-5、HT7）确认特异性

质谱（MALDI-TOF/LC-MS）：确认氨基酸序列、翻译后修饰（如磷酸化位点）

2. 构象与聚集性分析

圆二色谱（CD）：分析构象是否为随机卷曲（IDP特征）

透射电镜（TEM）/AFM：观察聚集状态（如PHFs形成）

Thioflavin T结合实验（ThT assay）：检测β-折叠聚集体荧光强度

3. 功能验证

微管共沉淀实验：检测Tau与微管结合能力

细胞模型诱导实验：验证Tau PFFs引起的Tau转导与聚集能力

科研应用与发展展望

Tau441重组蛋白在神经变性研究中具有广泛应用：

1. 构建体外聚集模型

可诱导Tau形成PHFs、SFs等病理构象，用于机制研究和抑制剂筛选：

添加肝素、RNA、脂质体等诱导剂促进Tau聚集

用于测试药物、抗体对聚集过程的影响

2. 细胞/动物模型构建

Tau PFFs已成为研究Tau跨细胞传播的重要工具：

在细胞内诱导Tau内源性聚集

在小鼠脑注射构建tauopathy病理模型

3. 磷酸化或突变体研究

构建疾病相关变体如P301L、V337M、S262E等，探索Tau的调控通路及其与GSK-3β、CDK5等激酶的作用关系。

4. 药物筛选平台

用于开发Tau聚集抑制剂、小分子调控剂及抗体疗法的体外高通量筛选模型。

参考文献

1.Wang Y, Mandelkow E. Tau in physiology and pathology. Nat Rev Neurosci. 2016;17(1):5–21.

2.Goedert M, Spillantini MG. Ordered assembly of Tau protein and neurodegeneration. Adv Exp Med Biol. 2019;1184:3–21.

3.Barghorn S et al. Structure, microtubule interactions, and paired helical filament aggregation by Tau mutants. J Biol Chem. 2000;275(24):17308–17314.

4.Fitzpatrick AWP et al. Cryo-EM structures of tau filaments from Alzheimer’s disease. Nature. 2017;547(7662):185–190.

5.Avila J, et al. Tau phosphorylation and aggregation in Alzheimer's disease and other tauopathies. Biochim Biophys Acta. 2004;1739(2-3):331–339.

6.Li W et al. Heparin-induced tau filaments are polymorphic and differ from those in Alzheimer's and Pick's diseases. Elife. 2018;7:e43584.

7.Iqbal K et al. Tau pathology in Alzheimer disease and other tauopathies. Biochim Biophys Acta. 2009;1792(7):641–648.

8.Hanger DP et al. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 2009;15(3):112–119.

9.Sahara N et al. Assembly of tau in transgenic animals. FEBS J. 2008;275(23):5765–5771.

10.Patterson KR et al. Characterization of prefibrillar Tau oligomers in vitro and in Alzheimer’s disease. J Biol Chem. 2011;286(26):23063–23076.

来源：辰辉创聚