Mol. Plant Pathol. | 小麦抗叶斑病遗传位点关键基因TaNADPO的遗传变异与抗病功能解析

摘要：2025年6 月8 日，国际植物病理学权威期刊Molecular PlantPathology（中科院1 区TOP，IF=4.8）在线发表了题为Wheat TaNADPO Promotes Spot Blotch Resistance的学术论文，成功解析了小麦

2025年6 月8 日，国际植物病理学权威期刊Molecular PlantPathology（中科院1 区TOP，IF=4.8）在线发表了题为Wheat TaNADPO Promotes Spot Blotch Resistance的学术论文，成功解析了小麦抗叶斑病遗传位点关键基因TaNADPO的遗传变异与抗病功能，为小麦抗病遗传改良提供了创新性基因资源和技术支撑。河北农业大学王逍冬教授和西北农林科技大学韩德俊教授为论文通讯作者，河北农业大学在读硕博连读生袁梦、西北农林科技大学曾庆东副教授、北京大学现代农业研究院华蕾副研究员、陈时盛研究员为论文第一作者。中国工程院院士、西北农林科技大学康振生教授对研究工作给予了指导。研究工作得到了国家重点研发计划（2023YFD1201000）、中央引导地方项目（236Z6501G）、山东省重点研发计划（ZR202211070163）、河北省杰出青年基金（C2022204010）、石家庄驻冀高校重点研发计划（241490012A）、河北省旱碱麦产业技术体系（HBCT2024030206）、华北作物改良与调控国家重点实验室自主课题（NCCIR2024ZZ-5/23567601H）的资助，并已申报国家发明专利1 项（202410899579.3）。

小麦是我国的重要粮食作物，其抗病稳产对我国粮食安全和农业发展具有重要意义。然而，随着全球气候变暖、秸秆还田、以及轮作制度和土壤微环境的变化，由麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana引起的小麦叶斑病发病面积持续增加，严重威胁小麦产量和品质。目前，小麦对麦根腐平脐蠕孢抗性的遗传基础尚未完全明晰，提高小麦对叶斑病的抗性仍然是控制这一病害的最有效途径。

本研究对来自全球的1302 份小麦种质资源采用0~5级的病害严重程度评级（DSR）标准评估叶斑病抗性，发现仅有3.8%表现出中度及以上抗性。利用高密度660K SNP数据进行全基因组关联分析（GWAS），在1BL染色体上（621.2~674.0 Mb）定位到一个包含9 个SNP的区段，与叶斑病抗性显著相关，命名为Qsb.hebau-1BL。并且其与先前报道的对叶斑病、叶锈病和条锈病具有广谱抗性的QTL（Qsb/Lr46/Yr29）接近。利用与Qsb.hebau-1BL位点相关的SNP数据，对9 个SNP进行单倍型分析，鉴定出Qsb (-)和Qsb.hebau-1BL两种主要单倍型。对其中关键SNP（AX-111002968）的基因型分析显示，携带Qsb.hebau-1BL单倍型的379份材料平均DSR值显著低于Qsb (-)单倍型的590份材料。基于该位点的SNP开发2 个dCAPS标记，用于区分抗性与感病基因型。

为了初步探究小麦抗叶斑病的转录特征，选取抗感病材料进行了转录组测序分析。选取了三个携带Qsb.hebau-1BL的抗性品系R522L_Emai18、R734L_XinXiang9178和R901L_ZhongYu9398，以及一个不携带Qsb.hebau-1BL的感病品系XY22L_Xiaoyan22，分别接种麦根腐平脐蠕孢和水后提取叶片RNA进行12 Gb Illumina测序，共鉴定143,540个转录本，生物学重复相关性高（R²>0.92），数据可靠。发现在抗性和感病小麦品系中，大多数病程相关（PR）基因家族在麦根腐平脐蠕孢侵染后均显著上调表达，表明植物对该病原体的防御机制广泛激活。

以“|Log2FC|>1且qQsb.hebau-1BL抗性基因的抗性品系R522L_Emai18_Qsb(1BL)，在受麦根腐平脐蠕孢侵染导致2,075个基因上调表达和1,121个基因下调表达。KEGG通路分析表明，感性品系病原菌处理组（XY22L_BS）与对照组（XY22L_CK）的DEGs，主要参与谷胱甘肽代谢、氨基糖代谢和苯丙氨酸代谢。抗性品系病原菌处理组（R522L_BS）与对照组（R522L_CK）的DEGs，在光合作用、苯丙烷类生物合成和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中富集。值得注意的是，抗病品系在MAPK 信号通路中，观察到明显的模式触发免疫（PTI）植物防御反应和脱落酸（ABA）植物激素信号激活。提示Qsb.hebau-1BL可能通过调控脱落酸（ABA）植物激素信号及PTI通路增强抗病性。

基于转录组测序数据，Qsb.hebau-1BL区间内的40 个注释基因中，仅有14 个基因可检测到表达量。进一步根据10 个含有Qsb.hebau-1BL的抗病材料和10 个不含有Qsb.hebau-1BL的感病材料的基因组重测序数据，发现仅有5 个基因在抗感病材料中存在关联遗传变异。其中，TraesCS1B02G410300基因编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸结合氧化还原酶（TaNADPO），在受麦根腐平脐蠕孢侵染后显著上调表达。利用qRT-PCR对5个抗感病关联变异基因进行表达模式测定，发现在麦根腐平脐蠕孢侵染后，携带Qsb.hebau-1BL的小麦品系中TaNADPO基因的表达水平在24 小时和48 小时均显著高于不携带Qsb.hebau-1BL的品系；而其他4 个基因未检测到显著差异表达，推测TaNADPO可能为小麦抗叶斑病遗传位点Qsb.hebau-1BL的关键功能基因。

为了验证TaNADPO基因在抗感病品系中的遗传变异，从10 个携带Qsb.hebau-1BL的抗叶斑病品系和10 个不携带Qsb.hebau-1BL的感病品系中扩增TaNADPO基因的基因组序列，确认TaNADPO基因编码区在抗感病品系间无差异，但启动子区域（-745、-557、-490、-121、-66 bp）存在5 个SNP，位于ABRE-like、RAV1AAT/AP2-like 等顺式作用元件内。基于上述遗传变异，开发了3 个基因特异性dCAPS标记。TaNADPO基因仅存在于普通小麦B基因组，其编码蛋白含有NADB_Rossmann 超家族结构域，在植物中保守。

为了初步探索TaNADPO的基因功能，通过农杆菌介导的烟草瞬时表达体系，发现GFP-TaNADPO和TaNADPO-GFP在烟草叶片中均显示细胞质荧光。为了检测超氧阴离子的积累，利用硝基蓝四唑（NBT）对农杆菌浸润的本氏烟草叶片进行染色表明，表达TaNADPO的烟草叶片中超氧阴离子的积累显著高于对照。为了初步探究TaNADPO在植物防御麦根腐平脐蠕孢中的功能，在烟草叶片中瞬时表达TaNADPO，两天后接种麦根腐平脐蠕孢，经台盼蓝染色发现，与空GFP对照相比，TaNADPO表达株系的细胞死亡面积显著减少，抗性增强。

为探究TaNADPO功能，构建了基因过表达小麦转基因材料TaNADPO-OE。通过qRT-PCR验证，发现TaNADPO转基因在不同家系中均呈现出高水平表达。在接种麦根腐平脐蠕孢10 天后，野生型植株叶片出现完全坏死，而TaNADPO-OE的叶片仅出现小面积病斑，表明TaNADPO-OE转基因小麦对叶斑病的抗性显著增强。此外，通过NBT染色观察接种后24小时麦根腐平脐蠕孢感染诱导的活性氧水平，与野生型植株相比，TaNADPO-OE的叶片在感染麦根腐平脐蠕孢后活性氧水平显著更高。

进一步获得了四倍体小麦TaNADPO同源基因TdNADPO的敲除型EMS突变体（tdnadpo-K2561，Gln125*）及野生型Kronos植株，接种麦根腐平脐蠕孢，检测活性氧水平及抗病表型。结果显示，与对叶斑病具有相对较高抗性的野生型植株相比，tdnadpo-K2561敲除变体对叶斑病的抗性明显降低。此外，在接种后48 小时通过NBT染色观察活性氧水平，结果显示与野生型植株相比，tdnadpo-K2561敲除株系在感染麦根腐平脐蠕孢时产生的活性氧水平显著更低。

再一步获得了普通小麦TaNADPO的敲除型EMS突变体（tanadpo-J10516796，内含子剪接变异体）及野生型“京411”植株，接种麦根腐平脐蠕孢，检测活性氧水平及抗病表型。结果显示，野生型“京411”对叶斑病表现出相对较高的抗性，而tanadpo-J10516796敲除株系对叶斑病的抗性显著降低。此外，在接种后48 小时通过NBT染色观察活性氧水平，在感染麦根腐平脐蠕孢时，tanadpo-J10516796敲除株系产生的活性氧水平比野生型植株更低。

综上所述，本研究发现1,302份全球小麦种质资源中，仅有3.8%表现出中等及以上叶斑病抗性。通过全基因组关联分析（GWAS），在1BL染色体上定位了一个与抗性显著相关的Qsb.hebau-1BL区域。该区段内的编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸结合氧化还原酶的基因TaNADPO在应对叶斑病时被显著诱导表达。过表达TaNADPO的小麦品系表现出抗性增强和活性氧（ROS）积累水平升高的现象。相反，四倍体和六倍体小麦中TaNADPO基因敲除突变体的抗性均降低，且ROS水平下降。研究表明，TaNADPO基因在赋予小麦对叶斑病的抗性中发挥关键作用，为培育抗叶斑病小麦品种提供了重要理论依据。