摘要：由微生物污染引发的食源性疾病已成为全球公共卫生面临的重大威胁。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）是细胞中的能量“货币”，其含量在每个细胞内基本相同。因此，基于荧光素酶催化的ATP依赖型生物发光方法被广泛应用于细菌检测。然而，荧光
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*本文首发于“纳米酶 Nanozymes”公众号，2024年12月10日江苏。
背景介绍
由微生物污染引发的食源性疾病已成为全球公共卫生面临的重大威胁。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）是细胞中的能量“货币”，其含量在每个细胞内基本相同。因此，基于荧光素酶催化的ATP依赖型生物发光方法被广泛应用于细菌检测。然而，荧光素酶通常需要在-20°C的条件下储存，并且在室温条件下易失活。此外，在传统的ATP-BL方法中，常用的化学类细菌裂解试剂（如三羧酸、十二烷基硫酸钠（SDS）和十六烷基三甲基溴化铵等）会抑制荧光素酶的活性。由于这些不稳定性和抑制作用，ATP-BL方法在野外微生物检测中的灵敏度（通常≤103 CFU/mL）和现场应用受到限制。虽然只有少数致病菌株对人类健康构成威胁，但单独的ATP-BL方法缺乏特异性，因为所有活的病原体均含有ATP。此外，ATP-BL方法无法提供有效的后续灭菌措施。因此，开发一种功能强大的多功能荧光素酶探针显得尤为重要，该探针不仅能在室温下长时间存储和运输，还能实现对活大肠杆菌O157:H7的快速现场检测和消除。
近期，宁波大学浙江省先进质谱技术与分析检测重点实验室的干宁教授和余镇重助理研究员报道了一种新型多功能荧光素酶探针，用于提高酶稳定性、检测灵敏度和杀菌效果，相关成果以"Three birds with one stone: A nano zeolitic imidazolate framework-luciferase-antimicrobial peptide biocomposite- based biosensing platform for improving enzyme stability, detection sensitivity, and sterilization effect"为题发表在国际化学权威杂志Chemical Engineering Journal上（DOI: 10.1016/j.cej.2024.156372）。宁波大学硕士研究生周仁杰为该论文的第一作者。
主要内容
本研究设计了一种强健型沸石咪唑酯框架-荧光素酶-抗菌肽（ZIF-90@Luc-AMP）生物复合材料。它具备三种功能：增强生物荧光素酶的稳定性和活性，显著提高检测灵敏度，有效杀灭活致病菌株（一石三鸟策略）。结合噬菌体修饰的搅拌棒，我们开发了一种新型多功能ATP-BL型生物传感器，可用于大肠杆菌 O157:H7活毒株的快速现场鉴定。
（1）克服了荧光素酶探针在室温下长期保存的困难。
在合成后30 天内，通过比较Luc、ZIF-8@Luc、ZIF-90@Luc 和 ZIF-90@Luc-AMP在室温和极寒极热条件下的生物活性以及在有机溶剂中的耐受情况来研究酶的稳定性。发现ZIF-90@Luc-AMP不仅在组别中保持最高的生物活性，而且在有机溶剂处理的情况下表现出优异的耐受能力。
（2）开发多功能酶探针提供了更强的检测性能。
在实时生物发光信号衰减曲线中，ZIF-90@Luc-AMP 在组别中显示出最高的 BL 信号，并具有最高的催化速率。使用手持式ATP 生物发光仪对大肠杆菌O157:H7进行检测时，ZIF-90@Luc-AMP的生物发光信号响应为游离荧光素酶的3倍。
（3）增强了杀菌效果。
用噬菌体-ZIF-90@Luc-AMP组合处理大肠杆菌O157:H7，其生物发光信号明显高于其他处理组合，并且信号到达平台期的速度更快。此外，在 25 °C 条件下，噬菌体-ZIF-90@Luc-AMP 组合的杀菌性能优于常规化学类细菌裂解试剂（SDS）。
示意图1. (A) ZIF-90@Luc-AMP的制备过程和(B)原理示意图。（来源：Chemical Engineering Journal）
图1. (A) ZIF-90, (B) ZIF-90@Luc, (C) ZIF-90@Luc-AMP的SEM图像。(D) ZIF-90、ZIF-90@Luc和ZIF-90@Luc-AMP的DLS光谱。(E) ZIF-90@Luc-AMP共聚焦显微镜图像。(F) ZIF-90、ZIF-90@Luc和ZIF-90@Luc-AMP的氮吸附-解吸等温线和(G) Zeta电位值。(H) ZIF-90@Luc-AMP的HAADF-STEM图像和C、N、O、S、Zn的EDX元素映射。(I) ZIF-90和ZIF-90@Luc-AMP的XPS全谱。(J) ZIF-90和(K) ZIF-90@Luc-AMP的C 1s高分辨率XPS光谱。(L)荧光素酶、ZIF-90、ZIF-90@Luc、SH-PEG-AMP和ZIF-90@Luc-AMP的FT-IR光谱。(M) ZIF-90、ZIF-90@Luc和ZIF-90@Luc-AMP的XRD谱图。（来源：Chemical Engineering Journal）
图2. (A)通过RF-6000荧光分光光度计测得的Luc, ZIF-8@Luc, ZIF-90@Luc和ZIF-90@Luc-AMP的底物浓度依赖性。(B)大肠杆菌（O157:H7）与噬菌体、噬菌体+ ZIF-90@Luc、噬菌体+ SH-PEG-AMP和噬菌体+ ZIF-90@Luc-AMP孵育后的ATP-BL信号。(C) Luc、ZIF-8@Luc、ZIF-90@Luc和ZIF-90@Luc-AMP分别在−20°C、4°C和25°C条件下保存30天后的稳定性研究。(D) ZIF-90@Luc-AMP捕获大肠杆菌O157:H7的SEM图像。(E)噬菌体搅拌棒的特异性实验。(F)噬菌体捕获细菌的透射电镜图像。(G) 抗菌肽的特异性实验。(H)噬菌体与抗菌肽结合的可行性实验。(I)活/死大肠杆菌O157:H7（102-105 CFU/mL）与ZIF-90@Luc-AMP孵育后产生的ATP-BL信号。（来源：Chemical Engineering Journal）
小结
本研究开发了一种纳米ZIF-90@Luc-AMP生物复合材料，该材料能长期保持荧光素酶的生物活性、灵敏地检测活致病菌，并且实现杀菌作用。因此，我们将这一策略命名为“一石三鸟”。研究表明ZIF-90@Luc-AMP生物复合材料在恶劣条件下可以维持30天的荧光素酶活性，克服了纯荧光素酶的不稳定性。将ZIF-90@Luc-AMP信号标签与噬菌体修饰的搅拌棒相结合，我们建立了一种超灵敏、超特异的生物发光检测方法，并应用于大肠杆菌O157:H7菌株，最低检出限为20 CFU/mL，检测时间仅为30 min。结合手持式生物发光仪作为信号读取装置，可用于野外痕量食源性致病菌的现场筛选。
来源：丽丽说科学
