摘要：细胞谱系特异性亚型的确定与稳定高度依赖于精确调控的转录级联反应。耳蜗包含两种机械感觉毛细胞(HC)亚型——内毛细胞(IHC)与外毛细胞(OHC)，以及多种支持细胞(SC)亚型。毛细胞与支持细胞均源自前体感觉细胞，这些前体细胞由关键转录因子(如Gata3)决定分

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细胞谱系特异性亚型的确定与稳定高度依赖于精确调控的转录级联反应。耳蜗包含两种机械感觉毛细胞(HC)亚型——内毛细胞(IHC)与外毛细胞(OHC)，以及多种支持细胞(SC)亚型。毛细胞与支持细胞均源自前体感觉细胞，这些前体细胞由关键转录因子(如Gata3)决定分化方向。Gata3在多种耳蜗细胞中广泛表达，并在耳蜗发育过程中发挥阶段依赖性及剂量依赖性的调控作用。IHCs与OHCs的细胞命运稳定和存活需要不同的转录因子调控，这表明二者涉及不同的分子机制。

来自中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心的刘志勇团队发现，转录因子Casz1在小鼠发育过程中对早期IHC命运巩固和OHC存活具有关键作用。Casz1缺失会导致IHC转分化为OHC，但不影响OHC的生成；然而Casz1突变体小鼠的OHC长期存活能力显著受损。进一步研究发现，Casz1缺失的IHC中转录因子Gata3表达下调，而过表达Gata3能部分挽救突变体小鼠的IHC特性、OHC数量及听力功能。因此，Casz1在早期IHC命运稳定和OHC存活中发挥双重关键作用，这一发现可能为同时再生IHC和OHC的治疗策略提供新思路。相关工作以题为“Casz1 is required for both inner hair cell fate stabilization and outer hair cell survival”的文章发表在2025年01月30日的期刊《Science》。

【Casz1基因在IHCs中持续表达和在OHCs中呈瞬时表达】

通过分析本研究团队之前的单细胞转录组数据集发现，编码锌指转录因子的Casz1在出生后30天（P30）野生型内毛细胞（P30_WT IHCs）中的表达水平显著高于野生型外毛细胞（P30_WT OHCs）（图1A，黑色箭头）。为探究Casz1在耳蜗感觉上皮中的发育动态，本文利用Casz1-3×HA-P2A-tdTomato/+（简称Casz1HA/+）基因敲入小鼠，该模型通过C端三个血凝素（HA）标签标记Casz1蛋白（图1B），从而可通过抗HA抗体直接观察蛋白表达。通过HA（标记Casz1）与前感觉细胞标志物Sox2的共免疫染色发现，Casz1蛋白在胚胎14.5天（E14.5）仅出现于Casz1HA/+耳蜗基底部的Sox2+前感觉细胞群（n=3只小鼠）（图1C和C'），这些细胞将分化为内毛细胞。与早期全毛细胞标志物Myo6的共染色显示，E15.5时Casz1表达迅速向耳蜗顶转扩展（n=3），呈现从基底部到顶端、从内毛细胞（内侧）向外毛细胞（外侧）递减的梯度分布。值得注意的是，耳蜗感觉上皮中许多细胞呈现Casz1高表达但Myo6表达极低或不可检测的现象，提示Casz1的表达启动早于Myo6，可能参与毛细胞早期发育调控。

出生后3天（P3）时（n=3），Casz1在内、外毛细胞中均呈现高强度均匀表达（图1D-E'），此时表达梯度消失。P10时内毛细胞表达量与P3相当，但外毛细胞出现从基底部到顶端的表达衰减（图S1E）。P10时顶端外毛细胞仍可检测到Casz1，而中基部外毛细胞几乎无表达（图S1F-H′′，n=3）。至P21时，Casz1在外毛细胞中完全消失，仅保留于内毛细胞（表达量较P3时期降低）（图1F-G'）。综上，Casz1表达始于E14.5的新生毛细胞，呈现基顶梯度与内外梯度；胚胎期和新生期同时存在于内外毛细胞，成年期则仅局限于内毛细胞（图1H）。虽然螺旋神经节细胞（SGNs）中可检测到Casz1，但在整个发育过程中耳蜗支持细胞始终无表达（以P3为例见图1E-E'）。此外，Casz1信号集中分布于类似早幼粒细胞白血病核体的核斑结构中。

图1 Casz1在小鼠耳蜗中的表达特征分析

【Casz1基因缺失导致内毛细胞向外毛细胞转分化及听力损伤】

由于心脏缺陷，种系Casz1−/−小鼠具有胚胎致死性。为探究Casz1在毛细胞（HCs）中的功能，本文通过杂交Atoh1Cre/+与Casz1flox/flox小鼠构建了条件性敲除小鼠Atoh1Cre/+;Casz1flox/flox（Casz1 CKO）（图2A）。至胚胎期14.5天（E14.5）时，Atoh1Cre/+已靶向绝大多数内毛细胞（IHCs）和外毛细胞（OHCs）。实验设置两类对照小鼠：Atoh1Cre/+和Atoh1Cre/+;Casz1flox/+，均未出现明显内耳异常。在P4对照组（Atoh1Cre/+）小鼠中，Casz1表达于毛细胞（n=3），而在Casz1 CKO小鼠中超过98%的毛细胞检测不到Casz1表达（n=3）（图2B-C），证实了毛细胞中Casz1的高效敲除。

通过标记OHC标志物prestin（Slc26a5）和IHC标志物vGlut3（Slc17a8），本文首先检测了P14时期毛细胞分化状态。与对照组（Atoh1Cre/+;Casz1flox/+）小鼠中prestin与vGlut3正常表达不同（n=3），Casz1 CKO小鼠（n=3）的vGlut3阳性IHCs中出现prestin异位表达（图S2B-B′′，箭头）。这种异常表达提示Casz1 CKO小鼠的IHCs可能已转分化为OHCs或类OHC细胞，因此本文将这些prestin阳性IHCs定义为源于内源性IHCs的诱导型OHCs（简称iOHCs）。值得注意的是，iOHCs中prestin表达水平低于内源性OHCs，而vGlut3表达水平与对照组IHCs相当。

图2 缺失Casz1时内毛细胞转分化为诱导型外毛细胞

在缺乏Casz1的情况下，外毛细胞（OHCs）会发生退化。本文通过检测早期OHC特异性标记物Bcl11b来探究Casz1是否在OHC发育过程中发挥作用。Bcl11b与vGlut3的双重免疫染色显示，在P1阶段，对照组（Atoh1Cre/+;Casz1flox/+）与Casz1条件性敲除（CKO）小鼠的OHCs中Bcl11b表达无差异（图3A至B′′），表明Casz1对OHC早期命运决定和分化并非必需。然而，Casz1 CKO小鼠的OHCs在P14阶段开始零星退化，至P42时通过prestin免疫染色计算的OHC数量显著减少（图2E至E′′）。扫描电镜图像进一步证实，Casz1 CKO小鼠在P14和P53（图3C和D）时OHC的数量和形态均出现异常。此外，所有耳蜗转中均出现类似的OHC缺失和形态异常（图3E），与对照组（n=4）相比，Casz1 CKO小鼠（n=4）的OHC平均减少24.7±2.4%（图3F）。值得注意的是，内毛细胞样OHCs（iOHCs）的静纤毛更类似于内毛细胞（IHCs）而非OHCs（图3C和D）。已知在Tbx2急性缺失时，IHCs会持续转分化为OHCs，但只有当Tbx2在胚胎期被删除时，IHCs才会表现出OHC样静纤毛。这表明Casz1 CKO的iOHCs可能错过了静纤毛重组所需的关键时间窗口。因此，Casz1缺失既诱导了IHC向OHC的转分化，又导致OHC退化，这两者均可能导致听力损伤（图2H）。综上，Casz1对维持IHC命运稳定和OHC长期存活具有重要作用。

图3 毛细胞前体细胞中条件性敲除Casz1导致外毛细胞退化

【与IHC向OHC转分化相关的细胞变化】

通过运动蛋白prestin（已知的OHC标志物）的免疫染色鉴定出诱导性OHC（iOHC），本文采用六种检测方法进一步研究P42 Casz1条件性敲除（CKO）小鼠中IHC向OHC转分化时是否伴随其他细胞变化。首先检测了非线性电容（NLC）——prestin介导的正常OHC标志特征。在Casz1 CKO耳蜗IHC区观察到两种不同大小的细胞（图4A、B），而非对照组（Atoh1Cre/+;Casz1flox/+）小鼠的均一IHC。电生理记录显示，仅小细胞（图4C红线，n=8）具有NLC特性，大细胞（图4C蓝线，n=6）则无；对照组OHC（绿线）和IHC（黑线）分别呈现预期结果（各n=11）。这表明Casz1 CKO小鼠IHC区的小细胞为prestin阳性iOHC。值得注意的是，这些iOHC的NLC振幅小于对照OHC，与其prestin表达水平较低一致（图2E-E′′）。通过电容线性部分估算细胞总表面积（图4C）发现：Casz1 CKO小鼠的iOHC和IHC表面积均显著小于对照组IHC（P

图4 诱导型外毛细胞获得外毛细胞特性并丧失内毛细胞特征

【采用单细胞全长转录组技术分析Casz1条件敲除小鼠内毛细胞】

为全面评估Casz1缺失后内毛细胞（IHCs）的转录组变化，本文通过双荧光标记系统手动分选IHC谱系细胞。实验采用基因型为Atoh1Cre/+;Casz1flox/flox;Fgf8FlpO/+;Rosa26LSL-GFP/FSF-tdTomato（简称Casz1 CKOGFP-tdTomato）的小鼠模型：其中Cre酶驱动Atoh1表达细胞激活绿色荧光蛋白（GFP），FlpO酶在Fgf8表达细胞中触发tdTomato表达。Fgf8作为围产期IHCs特异性标志物，在P14小鼠耳蜗中，IHCs（图5A-A′′）及部分非外毛细胞类型均呈现tdTomato标记。由于IHCs是唯一同时表达Fgf8和Atoh1的细胞，仅它们呈现GFP/tdTomato双阳性；而仅被Atoh1Cre/+靶向的耳蜗支持细胞则显示GFP单阳性，从而验证了该交叉标记策略的精确性。本文从P14 Casz1 CKO小鼠手动分选73个GFP+/tdTomato+ IHCs，立即进行基于Smart-seq的单细胞全长转录组测序（图5B）。将上述73个CKO IHCs与此前报道的55个P14野生型IHCs数据合并分析。UMAP降维展示了三个明确细胞簇（图5C）：野生型IHCs主要集中于簇0，而73个CKO IHCs分布于簇1和簇2（图5D）。其中簇2显著富集外毛细胞标志物Prestin（Slc26a5）（图5E），将TPM值>50的22个细胞定义为prestin+ iOHCs（转分化外毛细胞），其余51个为prestin- IHCs。与分类一致的是，prestin+ iOHCs中Slc7a14表达水平显著低于CKO组的prestin- IHCs及野生型IHCs（图5F）。

图5 P14期诱导型外毛细胞的单细胞RNA测序分析

【Gata3的过表达显著挽救了Casz1缺陷型内毛细胞的异常表型】

本文进一步探究了内毛细胞中Gata3下调是否会导致其向外毛细胞转分化，以及Gata3是否作为Casz1调控内毛细胞发育的关键下游效应因子。Gata3作为锌指转录因子，对内毛细胞发育至关重要。若Gata3在Casz1下游发挥稳定内毛细胞命运的作用，则强制表达Gata3应能挽救Casz1条件性敲除小鼠中转化外毛细胞（iOHCs）和内毛细胞的异常表型。为此，本文通过PiggyBac技术构建了可条件性过表达Gata3的转基因小鼠品系CAG-Loxp-stop-Loxp-Gata3-P2A-EGFP+（简称CAG-LSL-Gata3+）（图6A和图7A）。根据设计，经Atoh1Cre/+介导的重组后，过表达Gata3的细胞将同时表达EGFP。最终本文们获得Atoh1Cre/+;Casz1flox/flox;CAG-LSL-Gata3+（简称Casz1 CKO;Gata3oe+）小鼠用于分析。

为评估带状突触的修复情况，本文通过EGFP与Ctbp2双染色定量阳性点数量（图6B-D）。如图6E所示，Casz1 CKO;Gata3oe+小鼠EGFP+内毛细胞（图6D绿色虚线框）的Ctbp2+点状信号数（10.3±0.2）较Casz1 CKO小鼠内毛细胞（图6C红色虚线框，5.9±0.8）显著增加，但仍低于对照组Atoh1Cre/+内毛细胞（图6B白色虚线框，15.4±0.6）。此外，Nf200/EGFP/vGlut3三重染色显示，Casz1 CKO;Gata3oe+小鼠（n=3）中EGFP+/vGlut3+内毛细胞邻近的神经纤维密度与P42野生型对照组相当；而不表达EGFP/vGlut3的内毛细胞附近神经纤维密度则与Casz1 CKO小鼠（n=3）的iOHCs及内毛细胞同样低下。更重要的是，听性脑干反应（ABR）检测表明：在5.6-16kHz频率范围内，相较于P42 Casz1 CKO小鼠（n=5，红线），Casz1 CKO;Gata3oe+小鼠（n=6，蓝线）听力显著改善（图6F），但仍差于对照组（n=5，黑线）。图6G展示了11.3kHz下两组小鼠的ABR波形示例。单独过表达Gata3的Atoh1Cre/+;CAG-LSL-Gata3+小鼠（Gata3oe+，n=3，图6F绿线）与对照组ABR阈值无显著差异，表明Gata3过表达本身不影响毛细胞功能。

图6 Gata3过表达显著改善诱导型外毛细胞异常并部分恢复Casz1缺失小鼠的听力功能

【总结与展望】

本文发现，尽管Casz1不直接参与IHC或OHC的命运决定，但对维持IHC身份稳定性、调控OHC存活以及促进正常静纤毛形态形成具有关键作用。Casz1通过调控下游效应因子Gata3发挥功能——过表达Gata3能改善Casz1缺失导致的IHC和OHC表型缺陷，并提升Casz1敲除小鼠的听力水平。鉴于Casz1在毛细胞早期发育中的重要作用，本研究揭示了一条可用于开发听力恢复疗法的靶向遗传通路。

来源：EngineeringForLife一点号