摘要：解析配体-蛋白相互作用有助于全面揭示配体分子的生理功能和作用机制，进而为疾病治疗以及药物研发提供新的思路。由于蛋白质并非均一的整体，大多数配体与蛋白的结合仅发生在蛋白质的局部区域。鉴定配体结合区域能够直接为药物研发提供可供结合的位点，同时为深入研究药物-蛋白构

解析配体-蛋白相互作用有助于全面揭示配体分子的生理功能和作用机制，进而为疾病治疗以及药物研发提供新的思路。由于蛋白质并非均一的整体，大多数配体与蛋白的结合仅发生在蛋白质的局部区域。鉴定配体结合区域能够直接为药物研发提供可供结合的位点，同时为深入研究药物-蛋白构效关系提供重要指导。

2024年12月10日，中国科学院大连化学物理研究所叶明亮研究员团队和中国科学院上海药物研究所罗成研究员团队合作在Nature Methods期刊上发表研究论文，题为A peptide-centric local stability assay enables proteome-scale identification of the protein targets and binding regions of diverse ligands。根据配体结合会导致蛋白质结合区域稳定性的改变进而影响酶切效率的原理，发展了一种肽段为中心的蛋白局部稳定性探测技术（PEptide-centric Local Stability Assay, PELSA ）用于配体结合蛋白、结合区域的鉴定以及局部亲和力的测定。

叶明亮团队在国际范围内对PELSA拥有自主知识产权，其中中国专利已经授权。PELSA是目前基于配体免修饰类方法中具有最高灵敏度的技术，是研究配体-蛋白质相互作用的利器。

图1 PELSA方法可以直接从细胞裂解液中确定配体的靶蛋白质、结合位点和结合亲和力

PELSA技术基于配体结合蛋白微区域对酶切具有更高的耐受性而建立的。通过深度酶切策略，可以直接从蛋白质的天然结构状态中产生小肽段，来代表蛋白的局部稳定性。然后将这些小肽段与未被酶切的蛋白大片段分离开来。通过定量蛋白质组学鉴定丰度改变的肽段，进而分析这些差异肽段对应的蛋白质及其在蛋白质中的位置，可以在整个蛋白质组尺度上确定发生能量状态变化的蛋白质和蛋白质区域。

PELSA技术特色

一、不需要对配体进行化学修饰，提高数据真实性，降低鉴定结果的假阳性；另外对于不能进行化学修饰小分子结合蛋白的鉴定十分友好；

二、通过检测蛋白质丰度和结构变化两个维度信息，可同时获得配体结合蛋白和结合位点信息，具有高特异性和高灵敏度特点。如果加入药物浓度维度，还能够同时获得基于肽段的局部亲和力信息；

三、样品复杂度低，能够鉴定到大量包含配体结合信息的肽段。显著放大蛋白对配体结合的响应，具有极高的灵敏度；

四、能够广泛应用于多种类型配体 （药物、中药单体、天然产物、代谢物、金属离子和环境污染物等） 结合靶标蛋白的鉴定，并可在细胞裂解液和组织层次实现。

PELSA相对LIP-MS及其它免修饰方法的优势

PELSA与已有的限制性酶解-质谱分析（LiP-MS）方法相比将大大降低样品的复杂度，能鉴定到更多对配体有响应的肽段，更重要的是，PELSA 能明显放大靶蛋白配体结合区域的响应，灵敏度比LiP-MS高10倍以上。

与目前国际上最先进的能鉴定配体结合蛋白和结合区域的限制性酶切方法LiP-Quant技术 （LiP-MS的改进版） 相比，PELSA鉴定靶蛋白的灵敏度提高了12倍；与目前世界上最广泛使用的鉴定配体结合蛋白的蛋白质热转移分析方法（TPP）相比，PELSA的灵敏度是其1.7-2.4倍，而且还能提供结合位点的信息。

图2 PELSA方法在鉴定广谱激酶抑制剂结合蛋白质时灵敏度显著高于现有方法

PELSA在代谢物靶蛋白鉴定领域的应用

由于代谢物种类繁多，结构多样，有些分子结构简单，常以接近细胞生理浓度的亲和力 （微摩每升到毫摩每升） 与感受蛋白相互作用，二者相互作用的解析长期依赖于生物学家的生物学假设和实验，分析通量有限。PELSA能放大蛋白质对配体结合的响应信号，非常有助于研究弱亲和的代谢物在其作用蛋白上引起的微小稳定性变化。PELSA提出了一种新的代谢物弱亲和作用靶蛋白及其结合区域检测范式，为生化领域的研究提供了一种新的有效工具。

本工作开发的PELSA方法非常适合代谢物靶蛋白质的系统鉴定，研究人员利用PELSA方法一次性在HeLa细胞裂解液中鉴定到40个α-酮戊二酸的作用蛋白，其中有30个是大量文献积累的已知作用蛋白，说明该方法靶蛋白鉴定的高灵敏度和高可信度。研究人员进一步将PELSA方法应用于叶酸、亮氨酸、富马酸及琥珀酸等代谢物的作用蛋白鉴定，展示了该方法的广谱适用性。

本工作开发的PELSA方法在代谢物、药物及污染物的识别及作用机制解析等领域具有广泛的应用价值。

该工作的第一作者是叶明亮研究员的博士研究生李柯佳。

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来源：板鹭讲科学