摘要：近日，东南大学附属中大医院神经内科张志珺教授、罗雄剑教授和东南大学医学院孔岩副教授团队联合中科院深圳先进院/深圳理工大学以“The regulatory variant rs1950834 confers the risk of depressive diso

近日，东南大学附属中大医院神经内科张志珺教授、罗雄剑教授和东南大学医学院孔岩副教授团队联合中科院深圳先进院/深圳理工大学以“The regulatory variant rs1950834 confers the risk of depressive disorder by reducing LRFN5 expression”为题在BMC Medicine（中科院1区Top杂志）在线发表研究论著。该研究创新性结合遗传学和生物信息学、CRISPR-Ca9介导的基因敲除和单碱基编辑以及慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress, CUMS）诱导的抑郁样行为小鼠模型，发现并首次报道单核苷酸多态性位点rs1950834远程调控靶基因-富含亮氨酸重复序列和纤维结合蛋白III型结构域5（leucine-rich repeat and fibronectin type III domain containing 5, LRFN5）表达参与抑郁发生的重要作用，为抑郁症分子诊断和靶向干预提供了新的思路和实证。

张志珺教授、罗雄剑教授以及孔岩副教授为本论文共同通讯作者。栾迪、李一凡、张艾妮、柏晴晴和赵特为共同第一作者。本研究模式动物电生理测定相关研究得到中科院深圳先进院脑所朱英杰教授的支持和帮助。该研究获得2030-科技创新重大项目、国家自然科学基金重点和面上项目以及深圳科技基金等项目资助。

rs1950834 通过调控伏隔核LRFN5表达参与抑郁发病的分子机制示意图

抑郁症遗传度约37%，全球大样本荟萃全基因组关联分析（GWAS）发现了诸多单核苷酸多态性（SNPs）位点，但尚未确定任何致病基因，并亟待深入阐明风险变异位点参与抑郁发生的确切机制和功能意义。rs1950834变异位于人类14号染色体（14q21.1）LRFN5基因启动子区域，与抑郁症发病风险密切关联。初步的功能基因组学研究发现34个抑郁症风险SNPs位点破坏了11种转录因子结合，其中rs1950834A等位基因导致转录因子活性下降并增加抑郁发生风险，而其G等位基因具有保护性作用。LRFN5，又称为突触黏附样分子5（synaptic adhesion-like molecule 5, SALM5），作为Ⅰ型跨膜蛋白主要表达在神经系统并调控突触发育和功能，但其在抑郁发病中的作用尚未阐明。因此，本研究对rs1950834变异是否通过影响LRFN5在特定脑区和神经细胞类型中表达和功能参与抑郁症发病机制开展了深入研究。

首先，功能基因组学分析发现rs1950834位于开放染色体区域，并与转录激活信号H3k4me3、H3k4me1和H3k27ac密切相关。相较于G等位基因，其A等位基因的转录因子RAD21和POLR2A结合活性减低；通过在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株和胶质母细胞瘤U251细胞株进行双荧光素酶报告分析实验证实，rs1950834-A等位基因显著降低了启动子活性。电泳迁移率实验表明，rs1950834-A等位基因显著降低转录因子RAD21和POLR2A结合能力。染色体免疫共沉淀-定量PCR及DNA测序表明，转录因子RAD21和POLR2A结合rs1950834 DNA区域并受其等位基因变异影响。

对GEO数据集GSE172425和GSE 12543分析后发现，通过小干扰RNA敲减小鼠皮层神经元Rad21或在小鼠成熟神经元突变Polr2a会降低Lrfn5表达。进而在SH-SY5Y和U251细胞株敲减RAD21或POLR2A后证实LRFN5 mRNA和蛋白表达均显著下降。通过CRISPR-Cas9技术敲除或单碱基编辑SK-N-AS细胞后发现，rs1950834敲除或AA纯合等位基因显著减低LRFN5表达。与GG等位基因纯合细胞相比，转录组分析发现rs1950834 AA等位基因纯合细胞在未应激或地塞米松应激条件下分别有4567或5991个差异表达基因，并显著富集于突触和黏附分子通路。

对GEO数据库中转录数据进行荟萃分析后发现，LRFN5在抑郁症患者伏隔核这一情感环路核心脑区选择性显著下调，而非外周血以及前额叶皮层、杏仁核和扣带回等其他脑区。通过CUMS诱导抑郁样行为小鼠模型后发现，LRFN5在伏隔核神经元特异性显著下调，并与糖水偏好下降和强迫游泳不动时间增加均显著相关。通过脑定位注射腺相关病毒在小鼠伏隔核神经元特异性敲减Lrfn5可诱导小鼠出现抑郁样行为，并增加小鼠对CUMS慢性应激易感性。而该脑区神经元过表达Lrfn5增强了小鼠对CUMS应激抗性。与行为学结果一致，伏隔核神经元敲减Lrfn5加重CUMS引起的突触蛋白PTPRD、PSD95和SNAP25水平下降，以及树突棘总密度、短粗型树突棘密度和比例减少。而伏隔核脑区过表达Lrfn5可显著改善以上突触损伤。全细胞膜片钳记录发现CUMS可显著减少伏隔核脑区微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic currents, mEPSCs）频率而非幅度以及配对脉冲比率（paired-pulse ratio, PPR），但对微小抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic currents, mIPSCs）无显著影响。CUMS引起的伏隔核电生理改变可被该脑区神经元Lrfn5特异性过表达所逆转。

综上所述，本研究系统阐明了抑郁症相关风险变异rs1950834在单核苷酸水平调控靶基因LRFN5表达，进而影响伏隔核神经元突触功能参与抑郁症发病的分子机制，加深了对抑郁症遗传调控机制的认识，为抑郁症的精准诊断和干预策略提供新思路和新方法。（编辑刘敏 校对王倩 编审程守勤）

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来源：东南大学中大医院