摘要：草铵膦(phosphinothricin, PPT)是一种广谱除草剂，通过抑制谷氨酰胺合成酶的活性，阻断NH4+过度积累，最终导致叶绿体解体，植物死亡。PPT 具有除草效率高、毒性低、范围广、易降解、对环境友好等优点，随着百草枯和草甘膦的禁用，PPT 的市场份
摘自：《生物工程学报》2025-06
作者：汪曼曼; 杨宇; 宋显炳; 等
草铵膦(phosphinothricin, PPT)是一种广谱除草剂，通过抑制谷氨酰胺合成酶的活性，阻断NH4+过度积累，最终导致叶绿体解体，植物死亡。PPT 具有除草效率高、毒性低、范围广、易降解、对环境友好等优点，随着百草枯和草甘膦的禁用，PPT 的市场份额逐渐增大。但目前市售的 PPT 是一种外消旋混合物，含有50%不具有除草活性的 D-草铵膦(D-phosphinothricin, D-PPT)。因此，制备光学纯 L-草铵膦(L-phosphinothricin, L-PPT)对于提高原子利用率、降低成本和减轻环境压力具有重要意义。目前，L-PPT 的合成方法主要包括化学合成法和生物催化法。化学合成法包括不对称 Strecker反应、Michael 加成反应和外消旋拆分等，反应路线繁琐、反应条件严苛、产率低。相比之下，生物催化法因其高效性和立体选择性更具优势，主要包括：
(1) 以 PPT 衍生物为底物，利用酶法拆分得到 L-PPT，该方法可以获得对映体过量值(enantiomeric excess, ee)较高的 L-PPT。如有专利以 N-苯基乙酰-草铵膦为底物，利用大肠杆菌(Escherichia coli)来源的青霉素酰化酶将其拆分得到L-PPT。但底物价格昂贵，且理论产率不超过50%，生产成本过高，难以工业应用。
(2) 以 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸{2-oxo-4-[(hydroxy)(methyl)phosphinyl] butyric acid, PPO}为底物，在转氨酶或谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GluDH)的作用下，不对称氨化得到 L-PPT。Jin等利用肠沙门氏菌(Salmonella enterica)来源的转氨酶，以 L-丙氨酸为氨基供体催化 PPO 不对称氨化合成 L-PPT，经酶工程改造后获得突变体 SeTA-Y138F，其催化效率较野生型提升 4.36 倍；以500 mmol/L PPO 为底物进行全细胞转化，L-PPT 产率可达到 90.8%。虽然该体系展现出良好的工业化潜力，但化学法制备 PPO 的过程非常复杂，收率不足 40%且产生大量含磷废水，严重制约工业化应用。
(3) 利用 D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase, DAAO)催化 D,L-PPT 中的 D-PPT 转化为 PPO 是实现草铵膦高效生产的重要途径，但该过程仍面临多重挑战。Cao 等开发了一 种 DAAO-GluDH 双酶级联体系用于 D,L-PPT 的去消旋化。研究发现，野生型 DAAO 对 D-PPT 的 催化活性普遍低于 0.05 U/mg，这主要归因于其对 D-PPT 的底物特异性差、活性口袋适配性不佳以及催化机制限制等问题。此外，反应生成的过氧化氢不仅会导致关键中间体 PPO 脱羧，还会氧化 DAAO 的黄素腺嘌呤二核苷酸辅基和关键氨基酸残基，造成酶活性的快速衰减。针对这些限制因素，研究团队通过优化反应条件并引入高活性过氧化氢酶来消除 H22的负面影响，在 300 mmol/L 底物浓度下实现了 89%的 L-PPT 产率和大于 99%的 ee 值；虽然改造后的 DAAO 催化效率较野生型提升了 2.4倍，但其活性不足和 H因此，目前迫切需要开发一种环境友好、成本较低、产率较高的 L-PPT 制备方法。本研究采用多酶级联催化策略，通过 D-氨基酸转氨酶(D-amino acid transaminase, DAT)、谷氨酸脱氢酶和葡 萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase, GDH)的协同作用，实现 D-PPT 到 L-PPT 的高效转化(图1)。首先利用 DAT 将 D-PPT 转化为中间体 PPO。DAT 作为磷酸吡哆醛(pyridoxal 5'-phosphate, PLP)依赖性转氨酶家族成员，其独特的折叠Ⅳ型结构赋予其严格的立体选择性，通过双底物乒乓机制高效催化 D-氨基酸的转氨反应。随后，GluDH 将 PPO 转化为目标产物 L-PPT，该酶作为碳氮代谢的关键节点，其六聚体结构和动态构象变化确保了催化过程的高效性。同时，GDH 构建的辅酶再生系统实现了还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)的循环利用，显著降低了生产成本。
为提升该体系的工业化可行性，本研究重点优化了以下方面：
(1) 通过工程菌株的分批补料发酵工艺，显著提高了 DAT 和 GluDH 的表达活性；
(2) 采用多酶共表达策略增强系统稳定性；
(3) 建立了细胞级联催化的优化工艺参数。这种多酶协同的设计不仅解决了传统工艺中存在的平衡限制和辅酶消耗等关键问题，更体现了绿色化学和原子经济性的先进理念，为 L-PPT 的工业化生产奠定了基础。
图1 DAT、GluDH 与 GDH 级联催化制备 L-PPT
讨论与结论
本研究开发了一种基于 YM-1 DAT 和 LsGluDH-A175G 级联催化的新型 L-PPT 制备工艺，通过构建 E. coli YM-1 和 E. coli pLS 工程菌株并优化分批补料发酵工艺，实现了 YM-1 DAT 和LsGluDH-A175G/SyGDH 的高效表达，酶活分别提高 22.68%和 100.82%，同时 SyGDH 的共表达有效解决了辅酶再生问题。在优化后的反应体系，反应 8 h 时，D-PPT 的转化率达到 91.36%，L-PPT的 ee 值为 90.22%，展现出了优异的催化性能。
与现有文献报道的其他方法相比，本工艺具有显著优势。与 Cao等开发的 DAAO/GluDH双酶系统相比，本研究体系通过采用 DAT 替代 DAAO，从根本上避免了过氧化氢的产生，使反应体系更加简化高效，消除了 PPO 脱羧和酶氧化失活问题，同时无需添加过氧化氢酶，降低了成本。本研究通过共表达 SyGDH 实现了 NADPH 的原位再生，较专利中的工艺降低了辅酶成本。
表1 L-草铵膦生物合成的比较
本研究在反应效率、条件温和性和经济性方面具有明显优势。针对实验中观察到的物料不平衡和转化率与 ee 值的差异，深入分析表明有部分 D-PPT 通过副反应途径消耗，主要包括 PPO 脱羧与副产物 D-丙氨酸的生成，同时磷酸盐缓冲体系对反应进程也有一定的影响；而 ee 值偏低则源于 DAT 的逆反应、反应后期外消旋化和检测过程中的消旋化。基于本研究取得的成果和现存问题， 未来可以从以下几个方向进行深入探索：(1) 通过理性设计和定向进化对 DAT 进行酶工程改造， 重点提高其对 D-PPT 的立体选择性和催化效率，同时抑制逆反应活性；(2) 优化反应体系组成，特别是磷酸盐缓冲系统的浓度和 pH 值，以减少副反应发生并提高产物稳定性；(3) 探索连续流反应 器在该级联体系中的应用潜力，进一步提高生产效率和降低成本。这些优化方向将进一步提升该技术的工业化应用价值，为绿色生物制造 L-PPT 提供更完善的技术方案。
来源：世界农化网