摘要：然而，长期以来，源自小鼠肉瘤的基底膜提取物（如Matrigel）作为“金标准”主导市场，却因其动物源性饱受成分复杂多变、体内使用致癌风险高以及细胞提取困难等诟病。尽管众多合成替代品涌现，但它们在生物仿生（特别是结构和力学特性）和易用性上往往难以匹敌Matrig
还在为3D细胞培养中Matrigel基质胶的免疫源性、成分不明确、难以规模化和标准化以及临床转化性差而烦恼吗？
一篇新鲜出炉的《Nature Protocols》详细介绍了螺旋聚异腈多肽（PIC）水凝胶这一新型仿生基质的完整操作方案，为构建更稳定、可控且无动物源成分的3D细胞模型培养开启新思路！
文章介绍
题目：用于3D细胞培养应用的纤维状聚异腈多肽水凝胶
杂志：Nature Protocols
影响因子：16.0
发表时间：2025年5月
一、背景介绍
在组织工程、疾病建模和药物筛选领域，3D细胞培养模型因其能更真实模拟体内微环境而备受瞩目。
然而，长期以来，源自小鼠肉瘤的基底膜提取物（如Matrigel）作为“金标准”主导市场，却因其动物源性饱受成分复杂多变、体内使用致癌风险高以及细胞提取困难等诟病。尽管众多合成替代品涌现，但它们在生物仿生（特别是结构和力学特性）和易用性上往往难以匹敌Matrigel。
近日，国际顶级期刊《Nature Protocols》在线发表了题为《Fibrous polyisocyanide hydrogels for 3D cell culture applications》的详细实验方案，系统介绍了PIC水凝胶作为一种理想合成基质的制备、功能化、表征及在各类细胞（包括类器官）培养中的应用方法。
PIC水凝胶于2013年在《Nature》杂志上被首次报道。经过十余年开发，PIC水凝胶已被类器官鼻祖Hans Clevers在内的全球顶尖科学家和众多科技巨头公司所使用。
培养细胞种类包括干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、免疫细胞与神经细胞；培养类器官种类包括乳腺类器官、肝类器官、肝胆管类器官、肾类器官、前列腺类器官与唾液腺类器官；所构建疾病模型包括系统性纤维疾病等。
至今已积累了丰富的研究成果，相关研究发表在《Nature》、《Nature Materials》、《Nature Protocols》、《PNAS》、《Science Advances》和《Nature Communications》等国际知名期刊上。
二、什么是PIC水凝胶
PIC水凝胶由半柔性的螺旋聚异腈多肽聚合物组成，拥有类似于天然细胞外基质的非线性力学性质、纤维状的网络结构和利于物质扩散的微米级大孔径。
在材料设计方面，PIC组分明确，兼具可控性和可定制性：凝胶刚度可通过聚合物浓度和/或链长（例如PIC 2k 或PIC 5k）调控，满足大多数软组织范围；基于其灵活的结构设计，可通过“点击化学”的方式功能化修饰侧链基团，引入多肽、生长因子、抗体、DNA等生物活性分子，进而适用于不同的细胞种类，实现可定制生物应用。
此外，PIC水凝胶使用简便，具有可逆的温敏性质，低温液体，高温成胶。因此，细胞的封装和回收十分便利，可高效进行后续生物学实验（图1）。
图1. PIC水凝胶性质和应用概览。a. PIC聚合物结构及通过点击化学进行生物功能化修饰，例如细胞粘附肽、生长因子、抗体、DNA或染料等。b. PIC凝胶特性：温敏、非线性力学行为和纤维状结构。c. 细胞封装工作流程：升温成胶封装细胞，低温液体回收细胞。d. 代表性PIC细胞培养后续分析，包括免疫荧光、流式、PCR、Western Blot、分泌组学、药物测试等。
三、PIC水凝胶的特点与优势
多维度仿生：非线性力学性质、纤维状网络结构及大孔径；
性质可调：适用于大多软组织；
易于功能化修饰：无铜点击化学；
操作方便、省时：可逆温敏，升温成胶，低温液体（降温离心即可回收细胞）；
适合多方位表征：免疫荧光、流式、PCR、Western Blot、分泌组学、药物测试、细胞-基质互作等。
四、实验流程
本文覆盖了PIC水凝胶用于3D细胞培养的完整流程，具体包括：
1. 材料制备与生物功能化 (72h)：
详细步骤指导如何利用点击化学将小分子（如GRGDS肽）和大分子（如蛋白质bFGF）连接到PIC聚合物上（含关键步骤与注意事项）。
2. PIC水凝胶制备 (24h)：
指导如何溶解聚合物（关键：低温操作）、制备工作液、分装储存（避免反复冻融）。
3. 力学性能表征 (3h)：
使用流变仪测量线性和非线性力学性能（如储存模量G′，临界应力σc，应变刚化指数m）的标准流程（Box 2提供了详细的流变仪设置参数）。解释了如何解读流变数据。
4. 细胞培养应用（图2）：
2D培养 (1h)：在PIC凝胶表面培养细胞。
3D包埋 (1h)：核心步骤！将细胞悬液与冷的PIC溶液混合，点板后加热成胶。
类器官培养 (2周+)：以乳腺腺体类器官为例，详述了组织片段或单细胞在PIC-GRGDS凝胶中的封装、培养、传代流程。
图2. PIC细胞培养代表性结果。a–f. 3D PIC-GRGDS基质中间充质干细胞的形态 (a–c) 与2D普通PIC/Matrigel混合基质上MDCK细胞的形态 (d–f)。分别为代表性明场图像 (ad)、肌动蛋白染色图像 (be) 和免疫荧光染色图像 (cf)。注：如黄色箭头所示，YAP保留在细胞质中。g. 通过牵引力显微镜 (TFM) 绘制的PIC-GRGDS基质中细胞介导的基质位移图。h. PIC-GRGDS基质中细胞介导的机械重塑。黄色箭头显示纤维基质的明显致密化（粗箭头）和重组（细箭头）。i–k. 伪彩色编码（深度）共聚焦荧光显微投影图，显示人脂肪干细胞 (hAS) 在具有不同聚合物长度（相同聚合物浓度和GRGDS密度；短链，i；长链，j) 的PIC-GRGDS凝胶中，以及在PIC-N3凝胶（不含 GRGDS；k) 中的铺展情况。l. TempEasy 3D共培养系统的工作流程。L-PIC：5k PIC-GRGDS（长链）；S-PIC：0.5k PIC-GRGDS（短链）。
5. 细胞-基质互作研究：
免疫染色 (48h)：针对3D培养优化的方案。
增殖检测 (2h)：比较了CCK-8, WST-1, CellTiter-Glo, Live-Dead等多种方法在PIC凝胶中的应用要点。
细胞-基质相互作用：指导如何荧光标记PIC基质（用于共聚焦成像）并利用开源软件定量分析细胞牵引力诱导的基质重塑和位移。
6. 细胞提取 (1h)：
核心优势体现！简单冷却、离心即可获得细胞沉淀。
7. 下游分析：
提供从提取细胞中分离RNA（RNeasy kit 或 TRIzol法）、进行Western Blot以及定量细胞分泌的胶原蛋白和弹性蛋白的详细步骤。
8. 故障排除：
针对实验中可能遇到的常见问题（如凝胶无法形成、溶解困难、操作中凝胶碎裂、RNA/蛋白得率低等）提供了可能原因和解决方案。
五、应用案例及预期结果
以间充质干细胞为例，图2a-c展示了这些细胞在1k PIC-GRGDS中培养7天后的3D生长情况。此外，PIC也可用于2D细胞培养。
图2d-f展示了一项研究中肾源性犬肾上皮细胞（MDCK）的培养情况，结果显示细胞形态及其极性高度依赖于PIC水凝胶的性质。
PIC在生物物理表征中具有诸多独特优势。例如，通过SPAAC反应将荧光染料接枝至PIC网络，可借助共聚焦荧光显微镜对基质重塑进行可视化分析。
通常，细胞牵引力引起的基质收缩会在数小时内启动（图2g），但具体时间也与培养条件有关。类似地，图2h展示了PIC网络中的细胞的典型荧光图像。在细胞周围可观察到致密且有序排列的纤维网络，这是由细胞牵引力所驱动产生的。
图2i–k以人脂肪间充质干细胞（hASC）为例，说明通过调整聚合物链长和生物功能化修饰可以在多大程度上调控细胞行为。hASC仅在GRGDS功能化的样品中发生铺展，且在聚合物链长较短的样品中，其铺展能力明显更强。
结合不同聚合物链长的PIC，TempEasy平台支持定制化的间接3D共培养模型，用于研究旁分泌信号，并可轻松实现各培养区的独立回收（图2l）。这一应用拓展了PIC作为多种生理与病理研究模型的潜力。
类器官近年来受到越来越多关注，但在合成基质中成功实现类器官培养的案例仍极为罕见。初步研究结果表明，PIC水凝胶可支持多种组织来源的类器官扩增，包括乳腺、肝脏和唾液腺。
通常，新鲜分离的组织活检样本可直接包埋在PIC水凝胶中以启动类器官的构建（图3a）。以乳腺类器官为例，在PIC水凝胶中培养的组织碎片经历了形态变化、自组织和扩增过程，最终形成具有中央腔的双层结构。
培养7天后对K8和K14的共染色结果显示，这些类器官表现出正确的极性结构：外层为K14阳性的基底细胞层，内层为K8阳性的腔面细胞层（图3b）。
图3. PIC类器官培养的代表性结果。a. 在PIC水凝胶中分离和三维培养乳腺组织块的示意图。b.在PIC-GRGDS水凝胶 (2 mg/mL, 1k) 中培养乳腺组织块的不同时间点代表性明场及免疫荧光显微图像。
由于PIC水凝胶本身较为“精简”，因此对于不同类型的类器官，通常需要额外提供生化信号。例如，层粘连蛋白（laminin）是Matrigel的主要成分之一，对于形成功能性肝类器官是必不可少的。
有趣的是，RNA测序结果表明，无论是基于PIC还是Matrigel培养的类器官，其基因表达谱都与原生组织存在显著差异。然而，PIC水凝胶的可修饰性将有潜力实现与（人类）组织更高的一致性，从而相较于当前广泛使用的鼠源基质（如mBME）具有独特优势。
尽管越来越多的证据支持PIC在三维细胞培养中的优势，但在细胞类型、细胞结构、生化功能化等方面的应用仍有待进一步拓展。我们相信，该实验方案将为PIC的广泛应用和三维组织培养领域的标准化发展提供有力推动。
小结
这篇详尽的《Nature Protocols》为全球研究者提供了一份关于PIC水凝胶的“操作手册”。其多维度的仿生特性（纤维结构和非线性力学性质）、简便省时的可操作性（温敏）、高度的可定制性和无动物源性，使其成为替代Matrigel、推动3D细胞培养标准化和临床转化的强有力候选者。
随着更多研究团队采用这一方案，我们期待PIC水凝胶在再生医学、个性化医疗和药物开发等领域催生更多突破性成果！
3D细胞培养与类器官技术的发展正处于生物学、材料科学与工程学深度融合的关键时期。我们相信，推动PIC在科研与产业中的广泛应用，将有助于加速基础研究向转化医学与生物制造的跨越。我们诚挚期待与各领域同仁携手合作，共同推进3D细胞培养与类器官产业的繁荣与突破。
来源：培养盒守护者