摘要：重链抗体（HCAbs）是由两条重链组成，通过单一可变结构域识别同源抗原的无轻链抗体，也称为VHH、单结构域抗体（sdAb）或纳米抗体（Nb）。这些功能性的HCAbs是大约在30年前偶然发现的，存在于骆驼科动物中，包括单峰骆驼、骆驼、美洲驼、大羊驼和美洲驼。纳米
重链抗体（HCAbs）是由两条重链组成，通过单一可变结构域识别同源抗原的无轻链抗体，也称为VHH、单结构域抗体（sdAb）或纳米抗体（Nb）。这些功能性的HCAbs是大约在30年前偶然发现的，存在于骆驼科动物中，包括单峰骆驼、骆驼、美洲驼、大羊驼和美洲驼。纳米抗体由于其有益的特性：体积小、高稳定性、强抗原结合亲和力等，已成为生物医学研究和医学诊断和治疗的重要工具。
重链抗体的可变抗原结合域，体积约为传统抗体的十分之一，即纳米抗体，近年来其应用范围不断扩大。作为一类新型治疗药物，纳米抗体在生物医学应用中展现出超高的活跃度。在癌症治疗中，它们可以被定制为靶向肿瘤特异性标志物，有助于发现和定位肿瘤部位，或增强药物递送并最小化脱靶效应。它们穿越血脑屏障的能力在治疗神经性疾病方面尤其有利。除了肿瘤学和神经学领域，纳米抗体还被应用于传染病治疗和诊断中，凸显了其在不同医学领域的多功能性。自发现以来，纳米抗体已从实验室研究走向了实际应用治疗。而2019年首款纳米抗体药物Cablivi的问世，无疑极大地推动了这一领域的发展。
1. 驼类动物HCAbs的由来
基因的进化是由随机突变、基因流动、遗传漂变和自然选择等机制共同驱动的。这些机制随着时间的推移共同塑造了种群的遗传特性，可能使驼类动物能够应对和适应不断变化的病原体漂移和环境。
1.1自然选择
自然选择理论表明，驼科动物也许已发展出其独特的免疫系统，该系统基于二分抗体结构，以应对可能因恶劣环境条件而加剧的病毒威胁。病毒侵袭很可能是促使驼科动物体内由传统H链基因衍生出更能有效中和病原的重链抗体的原因。还有其他环境因素如热胁迫则促进了驼科动物热稳定性更强的重链抗体的出现。
1.2识别抗原的进化策略
研究重链抗体的遗传和结构可以为其进化适应策略提供额外的见解。与大多数哺乳动物一样，驼科动物利用V(D)J重组来产生抗体多样性。这些要素由IGHVH(VHH)-IGHD-IGHJ基因簇编码。对羊驼、双峰驼和单峰驼的序列分析显示，羊驼的IGHVH基因与骆驼属（Camelus）物种的基因有所不同，这可能是由于遗传流动事件导致的。
HCAbs还通过突变和遗传漂变而进化，使它们能够根据更简单的同源多聚化进行组装，并且在效果上甚至优于异四聚体抗体。HCAbs的可变区（VHH）显示出重要的突变和漂变，骨架区（FR）通过亲水性突变替代FR2中用于与轻链可变区（VL）相互作用的保守疏水性氨基酸，从而导致了VL域的丢失。
驼科动物HCAbs中CH1域的丢失归因于CH1和铰链外显子之间的内含子5'端的一个点突变（G＞A）。这一突变在所有产生HCAbs的驼科动物的IGHG基因中都是保守的。H链中缺少CH1域会阻止BiP结合伴侣蛋白与H链相互作用，并在L链取代H链之前将其保留在高尔基体中，从而使其能够从细胞中分泌出来。这种适应性变化，再加上FR2域中氨基酸的亲水性转变，增强了HCAb的溶解度（图1A）
VHH中扩展的CDR环，特别是延长的CDR1和CDR3区域，补偿了VH-VL组合多样性的缺失。在双峰驼和驼马中，CDR3区域较长，平均有17–18个氨基酸，它们在结构上增强抗原亲和力，包括对那些具有隐蔽表位的抗原（图1B）。
VHH中的非典型半胱氨酸形成额外的二硫键，稳定了长CDR3环并增加了抗原亲和力（图1C）。
在其他物种，如鸭嘴兽和鲨鱼中，也观察到了扩展的CDR环和额外的半胱氨酸桥。此外，驼科动物HCAbs中的铰链区域从长到短灵活不等，通过减少空间位阻显著影响了与抗原的结合（图1D）。
体细胞超突变（SHM）通过增加HCAbs可变区的突变率，促进了新型表位的出现，并维持了抗体多样性，尽管缺少了轻链可变域。
1.3 从软骨鱼类物种中获得的对适应性免疫系统塑造的见解
趋同进化（Convergent evolution）解释了不同物种中相似特征（如抗毒素能力）的独立发展。重链抗体（HCAbs）最初出现在软骨鱼类中，包括鲨鱼的IgNAR和全头类鱼的IgM HCAbs。具有相似序列特征和结构特性的重链抗体后来也在骆驼科动物中出现。鲨鱼是最早具有适应性免疫系统的脊椎动物，它们发展出了独特的IgNAR，其中包含一个负责抗原结合的可变区单域（VNAR）。鲨鱼VNAR在溶剂暴露区包含极性和带电氨基酸的保守区域展现出适应性结构变化，这些变化提高了其溶解度，而骆驼科动物HCAbs中的VHH似乎模仿了这一特征。尽管编码这些抗体的基因位点不同，但鲨鱼和骆驼中HCAbs的趋同进化表明，在它们的栖息地（如鲨鱼所处的高盐度和不同pH水平环境）中具有显著的进化优势。
而且这两种物种中的纳米抗体（nanobodies）都可以通过母体传递，有助于新生儿的免疫发育。例如，在羊驼初乳中发现了IgG HCAb的同型抗体，而在护士鲨的卵中则同时存在IgM和IgNAR，这凸显了它们在免疫系统中的关键作用。
2. 纳米抗体的应用
2.1 纳米抗体的扩展和商业化
自发现骆驼科动物重链抗体以来，仅仅三十年间，其可变抗原结合区——即VHHs或纳米抗体（nanobodies）——已应用在多个领域。它们体积小、稳定性高、抗原亲和力强，激发了巨大的商业兴趣，全球专利申请数量迅速增加，尤其是过去十年间。
2014年，全球纳米抗体专利申请首次超过1000项，此后每年增长20%（见图2A）。到2020年，已授权专利数量超过1000项，这表明纳米抗体产业正进入强劲增长阶段（见图2A）。
专利数量的增加反映了人们对纳米抗体研发的兴趣和投资显著增加。学术界、生物技术衍生公司和制药公司之间的合作有望进一步加速该领域的进步。
2.2 纳米抗体生产和应用方面的进展
构建纳米抗体库及其筛选技术以获取有效的单克隆纳米抗体非常高效。这些技术通常始于用抗原免疫骆驼科动物或转基因小鼠，激发免疫反应，并从免疫动物的血液中分离出淋巴细胞，再从这些淋巴细胞中提取RNA，并将其反转录为cDNA。以cDNA为模板通过聚合酶链式反应（PCR）扩增纳米抗体基因。将目的基因片段连接到载体上。将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，并在噬菌体或酵母上进行展示，以获取抗原特异性纳米抗体。然后，将这些获取的纳米抗体导入宿主以表达纳米抗体。从细菌培养物中收获表达的纳米抗体并进行纯化。最后，对纯化的纳米抗体进行表征和验证测试，以确认它们对同源靶抗原的特异性和结合特性（见图3A）。虽然免疫纳米抗体库是大多数筛选的标准，但合成库或天然纳米抗体正变得越来越受欢迎。此外，还设计了基于深度测序或质谱鉴定的替代筛选方法。
纯化的纳米抗体具有广泛多样的应用，包括了癌症治疗和脑相关疾病；在生物科学领域，用于复杂成像或调节细胞内抗原的存在和功能；甚至在植物科学中，用于增强植物对病原体的抵抗力。然而，纳米抗体在医学疾病领域的影响最为显著。
作为一类新型治疗性抗体，纳米抗体比传统抗体小得多且更稳定，具有从静脉渗出并容易扩散到组织中到达肿瘤特异性抗原的独特能力。此外，纳米抗体在通过特异性靶向趋化细胞因子配体（CCL2、CCL5、CXCR7、CXCL11和CXCL12）来对抗神经炎症性疾病方面也显示出前景，旨在通过抑制促炎细胞因子或其受体来调节免疫系统成分和对抗炎症。（见图3B）。
除了肿瘤学和神经学领域的应用外，纳米抗体在过去十年中展现出了惊人的多功能性，并将其用途扩展到传染病、生物毒素的检测和中和以及疾病诊断领域。在传染病中，纳米抗体可以通过结合进入宿主细胞所涉及的病原体关键蛋白来中和致病微生物,还被探索作为潜在药物，通过靶向和中和病毒进入细胞所涉及的糖蛋白，来减少病毒性出血热（见图3B）。
2.3 纳米抗体在医学成像和快速检测中的诊断应用
纳米抗体因其良好的生物分布特性和对疾病生物标志物的高亲和力，在诊断中的应用日益广泛。纳米抗体已与多种体内成像模式相结合，这些应用增强了图像的细节，有助于更好地理解和监测疾病，从而实现更早、更准确的诊断。
单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET）利用放射性同位素（如99mTc和111In）标记的纳米抗体进行成像，用于可视化包括肿瘤微环境和特定疾病标志物在内的各种目标。光学成像（OI）和超声成像利用基于纳米抗体的探针病变成像、术中成像和内镜检查等方面提高了特异性和灵敏度。
此外，纳米抗体的稳定性和溶解性使其能够在高温、极端pH值或有机溶剂存在等恶劣条件下使用。纳米抗体的这种稳健性对纳米抗体的制造和长期储存非常有益，使其特别适用于开发快速诊断测试，如侧向流免疫分析（FLT）、诊断ELISA和生物传感器（图3B）。
2.4 纳米抗体在其他疾病治疗中的治疗应用
纳米抗体的应用不仅局限于传染病的治疗。例如，在动脉粥样硬化中，抗Gal-2纳米抗体已被证明能够减小斑块大小并减缓斑块积聚的进程。此外，纳米抗体还被用于中和或靶向来自植物和动物的毒素。
2.5 作为细胞内探针的纳米抗体：技术、多功能性以及在研究和医学中的应用
2.5.1 细胞内靶向方法
纳米抗体的细胞内靶向主要通过两种方法实现：一是将编码纳米抗体的表达载体转染入细胞，二是纳米抗体蛋白递送结合细胞通透性增强技术。纳米抗体可以通过基因编码并与在表达载体中克隆的荧光蛋白（FPs）基因融合，转染后在细胞内生成“染色质体”，以靶向并可视化细胞内靶蛋白。这一过程使得活细胞成像和追踪靶蛋白运动成为可能。此外，纳米抗体可以连接到细胞穿透肽（cCPPs）上，以促进直接进入细胞质并避免内吞作用，从而提高标记效率并使其可用于药物递送。这种方法的一个例子是使用cCPP修饰的纳米抗体直接将治疗剂递送到细胞内，从而提高治疗的靶向性和有效性。
2.5.2 治疗应用
自噬靶向纳米抗体嵌合体（ATNCs）已被开发为一种多功能工具，用于选择性降解细胞内无法配体结合和不可成药的蛋白质，展现出潜在的治疗应用。例如通过靶向HE4蛋白来抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。小分子-纳米抗体邻近诱导共轭物（SNACIPs）已被开发出来以调节细胞内过程和内源性无法配体结合的目标，通过控制细胞功能和通过铁死亡和微管成核调控等靶向机制抑制癌细胞增殖，展示出治疗干预的潜力。一种基于细胞通透性的纳米抗体降解剂靶向BCL11A制剂，可有效诱导胎儿血红蛋白表达，通过使之前不可成药的蛋白质靶向降解，为血红蛋白病（如镰状细胞病和β-地中海贫血）提供了一种潜在的治疗方法。
2.5.3 递送技术
激光诱导的光穿孔技术能够实现标记纳米抗体的高效、低毒性递送入活细胞，从而允许对特定亚细胞结构进行高质量、长期的活细胞显微镜观察。使用诸如电穿孔、光穿孔和微流控细胞挤压等递送方法促进细胞进入，使得染色质体或荧光标记的纳米抗体能够可视化活细胞内靶标的动态过程。此外，它们的小尺寸最大限度地减少了靶标与荧光标记之间的距离，从而在超分辨率显微镜（SRM）中提高了分辨率。例如，染色质体已被用于追踪活细胞中的肌动蛋白动力学，而荧光标记的纳米抗体则使用随机光学重建显微镜（STORM）提供了突触蛋白的高分辨率图像。
2.5.4 成像应用
纳米抗体可与化学染料结合，使其适用于超分辨率显微镜（SRM）和其他高级成像技术。通过使用染料标记的纳米抗体作为直接探针来成像内源性蛋白，就不需要使用二级抗体。这些经过修饰的纳米抗体还减少了连接误差，提高了成像研究的分辨率。例如，荧光标记的纳米抗体已被用于在SRM中高精度地可视化微管结构，还被用于追踪参与细胞信号传导途径的蛋白质的动力学。纳米标签和纳米抗体在活细胞单分子成像中的应用，能够详细可视化并分析大肠杆菌中Z环的动力学，与传统荧光蛋白融合技术相比，提供了更高的分辨率和更少的干扰。
2.5.5 生物传感器
NanoB2将纳米抗体与NanoBRET技术相结合，促进了配体-膜蛋白相互作用的实时定量研究。因此，即使在内源性受体表达水平下，也能以高灵敏度确定平衡和动力学结合参数。V5标签导向的纳米抗体（NbV5）已被开发并优化为细胞内生物传感器，能够监测G蛋白偶联受体（GPCR）信号和动态蛋白质-蛋白质相互作用，同时对原生细胞环境的干扰最小。Intra Q-body探针源自单克隆纳米抗体，能够有效靶向并可视化活细胞中的细胞内p53，背景噪声低，从而能够根据p53表达水平进行精确的活细胞成像和分类。
2.5.6 用于特定蛋白质研究的工具
已经开发出一种基于纳米抗体的工具集，用于监测和修饰线粒体GTP酶Miro1。这种经过工程设计的纳米抗体为研究Miro1在线粒体动力学和神经性疾病中的功能作用提供了新的机会，可通过先进的生物化学、成像和细胞内调节方法来实现。此外，据报道，一种多功能的基于纳米抗体的工具包可用于分析从细胞表面开始的逆向转运，能够详细追踪蛋白质货物，并深入了解AP-1/网格蛋白机器在这一转运过程中的作用。纳米抗体作为强大的细胞内探测工具，能够靶向内源性蛋白质，避免了大量的修饰。这使得它们在基础研究和临床应用中都极具价值，为深入了解细胞过程和蛋白质功能提供了详细见解。
2.6 基于纳米抗体临床治疗和技术进展
一些基于纳米抗体的产品已成功从实验室研究转化为监管严格批准的临床试验。而由Ablynx开发的Cablivi是首个获得监管批准的基于纳米抗体的药物。它用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜（aTTP）。
另一种人源化HCAb的Envafolimab（Envida）在2021年获得中国国家药品监督管理局（NMPA）的批准。这是首个可皮下注射的抗PD-L1抗体，用于治疗微卫星高度不稳定（MSI-H）和错配修复缺陷（dMMR）的晚期实体瘤，。
2022年又相继批准了两种基于纳米抗体的药物，即（Ciltacabtagene Autoleucel）和Ozoralizumab（Nanozora）。Carvykti是一种嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法，分别于2022年2月和5月获得美国FDA和EMA的营销授权，用于治疗已接受过四条或四条以上先前治疗方案的复发或难治性多发性骨髓瘤（RRMM）成人患者。
这些纳米抗体药物的显著治疗效果不仅推动了各自靶向疾病的治疗领域的发展，还促进了纳米抗体生物药物在医学领域的认可和广泛接受。
3. 结论
骆驼科动物中的重链抗体的进化是大自然巧妙地将免疫系统适应于不断变化生态系统的一个例证。可能是对新抗原结合方式的需求促使骆驼科动物进化出HCAbs以抵御病原体侵害。这种方式的选择性优势必然十分巨大，才能解释这种独特的同源二聚体抗体在所有骆驼科动物中的广泛传播和保持。并且HCAbs其凭借其独特的结构及极小尺寸、单一抗原结合域与抗原结合的能力，为生物技术和医学领域开辟了新的可能性，从而推动了具有转化潜力的纳米抗体的发展。
纳米抗体正在彻底改变治疗方法，为癌症、神经性疾病和传染病提供靶向治疗。它们的小尺寸和稳定性增强了药物递送和诊断成像的效果，使其在早期检测和个性化医疗中具有不可估量的价值。已经上市的纳米抗体疗法彰显了它们对患者护理的影响，从而凸显了纳米抗体在现代医学中的变革潜力。
随着研究的深入，学术机构与产业界的合作可能会加速创新，为更复杂的应用提供解决方案。随着不断取得的临床成功和技术突破，纳米抗体预计将在未来发挥关键作用，帮助人们理解复杂的生物系统，或在医疗保健中改善患者结局。
来源：就会变得挑剔
