摘要：糖尿病周围神经病变(DPN )是糖尿病最常见 的慢性并发症之一,也是严重影响糖尿病患者生活 质量甚至致残的主要因素,目前临床尚缺乏行之有 效的治疗方法 。糖末宁颗粒剂是具有益气活血 、通 络止痛作用的中药复方在防治糖尿病周围神经病 变方面疗效确切 。通过观察糖

糖尿病周围神经病变 (DPN ) 是糖尿病最常见 的慢性并发症之一 , 也是严重影响糖尿病患者生活 质量甚至致残的主要因素 , 目前临床尚缺乏行之有 效的治疗方法 。糖末宁颗粒剂是具有益气活血 、通 络止痛作用的中药复方 在防治糖尿病周围神经病 变方面疗效确切 。通过观察糖末宁颗粒剂对坐骨神 经 NGF、IGF-1蛋白表达的影响 进一步探讨其作用 机制 , 以期为临床应用该药提供更为丰富的理论依据 也为中医药防治糖尿病周围神经病变的研究提 供新的思路 。

1 材料

1. 1 动物

健康雄性 W istar大鼠 36只 , 8周龄 体重 200 ~250 g,购于辽宁中医药大学动物实验中心 , 合格证号 :辽实动物 022号 。

1. 2 试剂及药品

链脲佐霉素 ( STZ)购于北京邦定泰克生物制药有限公司 (美国 Sigma公司产品 ) ,批号 : 050401。兔 多克隆 NGF、IGF-1抗体 、即用型SABC 免疫组化染 色试剂盒 :武汉博士德生物工程有限公司 。 HRP-羊 抗兔 IgG:中山生物技术公司 。糖末宁颗粒剂 :由营 口奥达制药有限公司制备 , 生产批号 : 990250 , 该药 现已上市 名为木丹颗粒 , 国药监准字号 080033 ,主 要成分黄芪 、丹参 、三七 、川芎 、鸡血藤等药物 、制成 的药粉 , 1 g药粉相当于生药 4. 28 g。

1. 3 主要仪器设备

透射 电 镜 ( JEM -1200EX 型 ) 、电泳仪 ( B IO - RAD) 、0. 75 mm垂直板电泳槽 (B IORAD ) 、半干转 印仪 (B IORAD ) 、自动电泳凝胶成像分析仪 ( Che- m in Imager 5500 , 美国 ) 、紫外分光光度计 (UV -160 日本岛津 )等 。

2 方法

2. 1 动物模型的建立与分组

大鼠适应性喂养1周后 按体重层次随机取10只为正常组 。其余按文献 [ 1 ]的方法复制模型。于造模前禁食 1夜 造模组大鼠次日晨单次腹腔内注射 2% STZ 53 mg / kg(pH 4. 2的 0. 1 mmol/L 枸椽酸缓冲液配制 ) ,正常组大鼠仅腹腔注射等体积的枸椽酸 缓冲液 , 72 h 后通过尾静脉测定血糖 , 大于 16. 65 mmol/L 者列入观察对象 。造模过程中除 2只未成模外 其余全部成模。将造模成功的大鼠按血糖层次再随机分成模型组及糖末宁组 每组各 10只大鼠。

2. 2 给药方法

糖末宁组大鼠灌胃 2. 3 g / ( kg ·d)糖末宁颗粒剂水溶液 模型组及正常组大鼠灌胃同容积的温开水 连续灌服 8周 。

2. 3 一般情况观察及血糖测定

实验过程中观察大鼠精神状态 、毛色 、进食量 、 饮水量及体重变化 每周尾静脉取血测血糖 。

2. 4 坐骨神经超微结构观察

实验至第8周末 采用腹腔注射20%乌拉坦4 mL / kg麻醉各组大鼠后 , 取大鼠一侧坐骨神经 (坐骨切迹至远端 1 cm) ,在 2. 5%戊二醛固定液固定48 h后 以磷酸缓冲液冲洗 在锇酸中固定后 用乙醇、丙酮逐级脱水 , Epon812包埋 行超薄切片 经醋酸双氧铀 - 枸椽酸铅双染色后应用透射电镜 (JEM21200EX型 )观察超微结构。

2. 5 坐骨神经 NGF、IGF21表达情况测定

大鼠麻醉后 充分暴露双侧坐骨神经 用剪刀将一侧坐骨神经从坐骨切迹处及胫腓神经分叉处剪断后 迅速放于液氮罐内 实验结束时全部移至 - 80 ℃冰箱内保存 待蛋白印迹检测用 ;另一侧坐骨神经取长约 1 cm,置于 10%甲醛溶液中固定后 常规石蜡包埋、切片 用于免疫组化检测。

2. 5. 1 免疫组化检测

坐骨神经 7μm石蜡切片常规脱蜡至水 ; 3% H2 O2 处理10 min灭活内源性酶 ;切片浸入 0. 01 mol/L 柠檬酸盐缓冲液热修复抗原10 min;滴加5%BSA 封闭液 室温 20 min;滴加一抗 ( 1 ∶200稀释 ) , 4 ℃下过夜 ;滴加生物素化二抗(山羊抗兔 IgG) , 37℃孵育20 m in;滴加试剂SABC, 室温下孵育 30 min。以上各步骤之间除滴加 5%BSA外均用 0. 1 mol/L PBS洗 3次 每次 5 min; 使用 DAB 试剂盒显色 蒸馏水充分洗涤 脱水封片。 阴性对照以 0. 1 mol/L PBS代替一抗 其余步骤如前。 显微镜与 Metamorph offline图像分析系统相连 测定积分光密度 ( Integrated OD Total)以备统计分析。

2. 5. 2 W estern印迹检测

用电动匀浆机提取蛋白后用考马斯亮蓝法进行蛋白定量 各样品取等量蛋白经SDS-PAGE 电泳转膜 封闭 。加入一抗 (NGF、IGF-1 , 1 ∶200 稀释 ) 孵育后 与二抗 ( HRP-标记 的羊 抗兔 IgG) , 室 温 孵 育 。 特异性的反应条带通过 AP 显色后 , 采用自动电泳凝胶成像分析仪 ( Chem i Imager 5500 , USA)进行蛋白条带的灰度值扫描 计算目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值 , 以该比值来表示 NGF、IGF- 1蛋白表达的相对强度。

2. 6 统计方法

采用SPSS软件包进行数据分析 实验结果以均数±标准差 ( x- ±s)表示 , 组间比较采用 ANOVA 行单因素方差分析 并用 LSD 法进行两两比较 , 以 P 作为显著性差异的标准 。

3 结果

3. 1 一般状态观察

正常组大鼠精神饱满 活动灵活 体重呈上升趋势 。模型组大鼠精神萎靡 少动 毛发无光泽 , 多饮 、 多食 、多尿症状典型 体重明显下降 。糖末宁组大鼠上述症状较轻 一般状态好于模型组。

3. 2 各组大鼠坐骨神经超微结构变化正常组结果见图 1A。

模型组大鼠坐骨神经有髓神经纤维的髓鞘明显增宽 板层结构紊乱、分离 其间有水肿液和崩解的碎片 有的髓鞘出现斑块状脱髓鞘和节段性脱髓鞘。

轴索萎缩 , Schwann细胞变性、坏死呈细胞碎片 无髓神经纤维和神经膜线粒体嵴减少 毛细血管扩张充血 炎细胞浸润。结果见图 1B。糖末宁组大鼠坐骨神经可见新生的有髓神经纤维 轴突内可见微丝、微管、线粒体等结构。坐骨神经髓鞘出现斑块状变化 板层分离现象明显减轻 可见少量空泡样改变。结果见图 1C。

3. 3 各组大鼠坐骨神经 NGF蛋白表达情况

3. 3. 1 蛋白印迹检测结果

模型组大鼠坐骨神经 NGF蛋白表达水平低于正常组 ( P 糖末宁组高于模型组 ( P

0. 05) ,但低于正常组 ( P 。结果见图 2。

3. 3. 2 免疫组化染色结果

模型组大鼠坐骨神经雪旺氏细胞及轴突 NGF 表达强度明显低于正常组 ( P 经治疗 糖末宁组表达强度明显高于模型组 ( P 。结果见 表 1。

3. 4 各组大鼠坐骨神经 IGF-1蛋白检测结果

3. 4. 1 蛋白印迹检测结果

模型组大鼠坐骨神经 IGF-1蛋白表达较正常组大鼠明 显 减 弱 , 糖 末 宁 组 表 达 强 于 模 型 组 ( P 但弱于正常组 ( P 。结果见图 3。

3. 4. 2 免疫组化检测结果

模型组大鼠坐骨神经雪旺氏细胞及轴突 IGF21表达强度较正常组明显下降 ( P 糖末宁组表达强度高于模型组 ( P 与正常组比较无显著性差异。结果见表 2。

4 讨论

近年来神经营养因子缺乏在 DPN 研究领域备受关注 。周围神经组织中神经营养因子的表达及合 成减少使神经元及雪旺氏细胞在糖尿病环境中易于发生病变 。DPN 易累及躯体感觉神经和交感神经 , 与 NGF作用的组织吻合 提示 NGF合成减少 、逆轴 浆运输障碍 、NGF受体表达异常可能是 DPN 的发病 机制 [ 2 - 5 ] 。胰岛素样生长因子 ( IGFs) 是另一种神 经生长因子 , 已有研究表明神经自分泌或旁分泌组织 IGF-1基因下调 可能参与了 DPN 的发生 [ 6 - 8 ] 。

糖末宁颗粒剂是以中医基础理论为指导 结合多年临床经验研制出的用于防治 DPN 的中药复方制剂。既往研究表明 [ 9 - 12 ] , 该方可通过不同的途径实现对DPN的防治作用 其主要作用及机制表现在提高糖尿病大鼠坐骨神经 Na+ -K+ -ATP 酶活性 、降低DM 大鼠红细胞山梨醇含量 、改善 DPN 患者血浆 β - 内啡肽水平 提高痛阈 、改善血液流变学异常 、上调DM 大鼠坐骨神经 NGF mRNA、IGF-1 mRNA 的表达及提高 DM 大鼠坐骨神经中 cAMP、cGMP 的含量 。 实验结果表明 模型组大鼠坐骨神经轴突及雪旺氏细胞的 NGF、IGF-1表达强度较正常组明显下降 提示 在 DPN 早期存在 NGF、IGF-1表达的减少 这可能与轴突及雪旺氏细胞的损伤导致 NGF、IGF-1合成减少及逆转运障碍有关 。在应用糖末宁颗粒剂治疗后 大鼠坐骨神经上述 2种因子表达强度明显高于模型组( P 说明糖末宁颗粒剂对大鼠坐骨神经的 NGF、IGF-1表达水平有一定上调作用 通过对这2种神经营养因子的调节起到保护神经的作用 。

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来源：聚智健识