前献解泌第37期 | 刘建业教授与您共同探讨谱系特异性代谢控制前列腺管腔分化和抗雄激素治疗反应的机制

摘要：本期与我们用声音见面的是中南大学湘雅三医院刘建业教授，他将与大家一同分享一项近日发表于《Nature Cell Biology》杂志的一项探索谱系特异性代谢控制前列腺管腔分化和抗雄激素治疗反应机制的研究。

聚前沿文献之声，解泌尿学术之惑

聚前沿文献之声，解泌尿学术之惑，这里是聚焦前列腺癌的《菲长视野 · 前献解泌》专栏。

本期与我们用声音见面的是中南大学湘雅三医院刘建业教授，他将与大家一同分享一项近日发表于《Nature Cell Biology》杂志的一项探索谱系特异性代谢控制前列腺管腔分化和抗雄激素治疗反应机制的研究。

研究背景

前列腺上皮包括基底细胞和管腔细胞以及较为罕见的神经内分泌细胞。成年小鼠的前列腺基底细胞和管腔细胞在生理条件下是自我维持的。谱系转变是前列腺发育、肿瘤发生和治疗耐药的关键特征。基底祖细胞向管腔细胞的分化发生在发育、组织再生、炎症和前列腺癌起始阶段。表观遗传学的改变促进前列腺上皮特性的建立与维持，但目前仍不清楚上游信号如何调节前列腺上皮细胞的谱系转变。因此，本研究通过对原代前列腺上皮细胞进行代谢组学分析，以明确前列腺上皮细胞类型特异性代谢特征，并阐述了代谢调节在前列腺谱系转变中的作用及机制[1]。

研究方法

本项研究对前列腺上皮细胞进行代谢谱分析和重同位素营养示踪法，分析不同类型前列腺上皮细胞的代谢特征，并验证了代谢调节在前列腺谱系转变中的作用及分子机制。

研究结果

● 基底细胞和管腔细胞具有不同的代谢特征

为了研究前列腺上皮细胞类型和代谢特性之间的关系，研究者使用荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）分离原代基底细胞（EpCAM+CD49fhigh）和管腔细胞（EpCAM+CD49flow），并开展了核糖核酸测序（RNA-sequencing，RNA-seq）、代谢分析和葡萄糖追踪等实验（图1a）。典型谱系标记的转录分析验证了上皮细胞群的分离。基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）结果显示，在差异基因最丰富的30条通路中，有12条与代谢相关。对所有代谢相关基因进行GSEA，在基底细胞中发现MYC靶点的富集；在管腔细胞中发现丙酮酸代谢和氧化磷酸化的富集。此外，研究还发现在基底细胞中，有几种糖酵解酶和转运体的RNA和蛋白质丰度增加，而在管腔细胞中，多种关键三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环酶水平升高（图2c）。对小鼠前列腺进行单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq），证实了不同上皮细胞亚群中代谢酶的差异表达。

随后，研究者建立了一种方法，可以通过代谢谱和营养示踪对不同类型前列腺上皮细胞进行代谢表征，结果显示，基底细胞的糖酵解代谢物（PEP、3PG和F6P）水平升高，而管腔细胞的TCA循环中间体（异柠檬酸盐、aKG和琥珀酸盐）水平升高（图1d）。葡萄糖示踪显示,在管腔细胞中,葡萄糖衍生的碳，在从柠檬酸盐代谢为乌头酸盐的过程中减少,可能是合成了脂质，但在基底细胞中没有，后续的实验进一步证实了这一点（图1e-f）。此外，葡萄糖示踪实验结果还发现，管腔细胞通过丙酮酸脱氢酶途径优先生成M2柠檬酸盐，而基底细胞则优先生成M3柠檬酸盐（图1h-i）。上述数据表明，管腔细胞和基底细胞具有不同的代谢物丰度分布以及营养利用模式。

图1 原代前列腺基底细胞和管腔细胞具有不同的代谢特征

● 基底细胞向管腔细胞的分化过程伴随着丙酮酸氧化

随后，研究者进一步评估了在基底细胞分化为管腔细胞的过程中，是否存在代谢重编程的证据。GSEA分析结果显示，相较于基底分化的管腔细胞，多能基底细胞中的氧化磷酸化基因负富集（图2b）。前列腺类器官具有从基底细胞向管腔细胞分化的特征，基底细胞衍生的类器官最初表达高水平的基底标志物Trp63（p63），但是管腔标志物细胞角蛋白8（cytokeratin 8，KRT8）的表达水平较低，体外培养5天以后，KRT8升高，p63降低，在分化的过程中，涉及到了代谢重编码（图2c-d）。

在类器官培养后第3、5、7天进行了代谢谱分析和葡萄糖示踪分析，主成分分析（principal component analysis，PCA）结果显示，每个时间点中标记的代谢产物均独立分布（图2e）。在培养的第3-7天，糖酵解代谢产物中，葡萄糖来源的碳原子数量并无显著变化，但TCA循环中间体的比例逐渐升高（即管腔分化的丙酮酸氧化增加），而核苷酸中间体的比例逐渐下降（图2f-h）。上述数据表明，基底细胞到管腔细胞的分化与代谢重组有关，其中包括葡萄糖氧化增加的转移。

图2 基底细胞向管腔细胞的分化过程伴随着丙酮酸氧化

●线粒体丙酮酸载体（mitochondrial pyruvate carrier，MPC）可以调节基底细胞的分化

MPC将丙酮酸从细胞质运输到线粒体，在线粒体中丙酮酸可以被氧化，为TCA循环提供燃料。研究者观察了小分子MPC抑制剂UK5099对基底细胞分化的影响。葡萄糖示踪分析结果显示，UK5099显著减少小鼠基底细胞源性类器官中葡萄糖衍生碳与TCA循环中间体的结合（图3a），且对类器官的形成速率及大小无显著影响（图3b-c）。蛋白印迹和免疫荧光结果显示，UK5099降低了KRT8的表达，增加了p63的表达（图3d-e），流式细胞术也证实了这一点（图3f-g）。

随后，研究者敲除Mpc1（Mpc1-KO），发现在基底细胞来源的类器官中，TCA循环中间体中葡萄糖来源的碳数量显著降低（图3h）。敲除Mpc1后，蛋白印迹结果与使用UK5099一致（图3i），RNA测序结果表明，与对照组相比，敲除Mpc1和使用UK5099后，类器官的管腔特征负富集，而基底特征正富集（图3j）。上述结果在细胞水平上也得到了相似的结论，抑制MPC使管腔表型细胞数量减少，而上皮-间质转化样细胞的比例随着MPC抑制而升高（图3l-n）。综上所述，代谢调节可以改变前列腺上皮细胞的特性，MPC是前列腺上皮细胞谱系特性的关键调节因子。

图3 抑制或敲除MPC可以预防基底细胞向管腔细胞分化

● MPC是前列腺癌谱系身份的调节因子

在前列腺癌中，肿瘤抑制基因Pten和Rb1缺失非常常见，既往Pten和Rb1双缺失的基因工程小鼠模型概括了前列腺癌的关键特征。研究者使用Pten单敲除（single knockout，SKO）和Pten、Rb1双敲除（double knockout，DKO）基底细胞来源的类器官模型，发现使用UK5099治疗后，两种类器官模型中管腔标志物KRT8和KRT18的表达水平均下降（图4a），RNA测序进一步证实了UK5099处理后，DKO类器官中典型管腔标志物表达下降，基底标志物表达上升（图4b），并在多种人源性前列腺癌模型中得到验证，表明MPC是小鼠前列腺类器官和人类前列腺癌模型中谱系身份的调节因子。

随后，研究者评估了前列腺癌样本中MPC表达与谱系特征之间的关联。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TGCA）中499例原发性前列腺癌的RNA-seq相关性分析显示，MPC1和MPC2的RNA丰度与管腔标志物KRT8和KRT18的RNA丰度正相关，并在第二军医大学（Second Military Medical University，SMMU）和Beltran等人的数据集中得到了验证，发现MPC1和MPC2转录本丰度水平与管腔特征评分正相关（图4c-f）。此外，研究还发现，与前列腺腺癌相比，神经内分泌前列腺癌（neuroendocrine prostate cancer，NEPC）中MPC1的RNA丰度无显著差异，而MPC2的丰度显著下降（图4g-j），表明MPC RNA丰度与不同疾病状态下的管腔谱系身份正相关。

图4 MPC是前列腺癌管腔谱系身份的调节因子

● 乳酸堆积导致染色质重构

研究者进一步评估了MPC抑制拮抗管腔谱系身份的机制，并假设MPC抑制使得细胞质中丙酮酸可用性增加从而导致乳酸堆积。代谢足迹和代谢谱结果显示，UK5099处理增加了细胞内和细胞外的乳酸丰度水平（图5a）。此外，补充乳酸降低了KRT8的蛋白丰度，增加了p63的蛋白丰度（图5b），使用单羧酸转运蛋白1（monocarboxylate transporter 1，MCT1）降低胞外乳酸丰度后，管腔特征减少，表明胞内乳酸堆积驱动了谱系改变。有研究报道，乳酸可以抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）活性。本研究发现，抑制HDAC活性可拮抗前列腺类器官的管腔特征并增强基底特征（图5c-d）。此外，研究发现抑制MPC和抑制HDAC对基因表达有相似的影响。上述数据表明，MPC抑制和乳酸堆积可能通过改变HDAC从而调节谱系转变。

研究对UK5099和乳酸处理的类器官模型进行染色质可及性测序（assay for transposase-accessible chromatin sequencing，ATAC-seq），发现UK5099和乳酸补充所观察到的染色质可及性整体增加，与HDAC活性抑制介导的表型一致（图5f-g）。此外，研究通过对UK5099处理或乳酸补充后的类器官模型进行转录因子基序分析，发现抑制MPC和补充乳酸均促进了关键谱系特异性转录因子的基因的大规模染色质重构（图5h-l）。

图5 细胞内乳酸堆积导致关键谱系特异性转录因子的大规模染色质重构

● 乳酸代谢调节改变抗雄激素反应

鉴于谱系可塑性转变与雄激素通路抑制剂的耐药性有关，研究者评估了MPC表达是否与前列腺癌的治疗反应有关。分析多个数据集中的RNA测序数据，研究发现与对治疗无反应的患者相比，对治疗有应答的患者KRT8和KRT18的RNA丰度更高，MPC1和MPC2的丰度也有所增加（图6a-d），表明高MPC RNA丰度与增加的管腔特征和对雄激素通路抑制的更好应答正相关。

随后，研究者假设增加乳酸的代谢操作会导致对抗雄药物恩扎卢胺的耐药性增加，并进行了验证。研究发现，与空白对照相比，UK5099处理显著降低了前列腺癌细胞对恩扎卢胺的敏感性，并且恩扎卢胺诱导的肿瘤细胞增殖减少和细胞凋亡随着乳酸堆积逐渐减弱。在去势抵抗前列腺癌患者的患者来源异种移植（patient-derived xenograft，PDX）模型中，UK5099治疗和乳酸治疗降低雄激素受体信号，增加神经内分泌样标志物的表达（图6e-f），表明增加细胞内乳酸丰度可以调节前列腺癌对抗雄治疗的应答。

图6 调节乳酸代谢改变了前列腺癌对抗雄治疗的应答

研究结论

不同类型的癌症对MPC和糖酵解代谢有不同的依赖性，在前列腺癌中，脂肪生成和氧化磷酸化需要高MPC活性，而MPC失活抑制肿瘤生长。此外，破坏前列腺癌细胞中乳酸依赖性脂质重编程可以抑制肿瘤生长和转移。该研究表明，MPC抑制和乳酸堆积可能使前列腺癌对抗雄治疗产生耐药。靶向代谢酶和转运蛋白可能会影响前列腺癌的谱系可塑性和治疗反应，并为临床治疗提供新的靶点。

专家有话说

谱系转变是前列腺发育、肿瘤发生和治疗耐药的核心特征。因此，确定谱系转变的调控机制及关键因子是解决前列腺癌抗雄治疗耐药的重要研究方向。本研究通过对原代前列腺上皮细胞进行代谢组学研究，发现MPC和乳酸堆积是前列腺细胞管腔特征的调控因子，抑制MPC或补充外源性乳酸均会导致大规模染色质重塑，诱导前列腺癌对抗雄治疗耐药性的产生，阐述了前列腺上皮谱系特性的代谢调控机制，也为前列腺癌的治疗和靶向药物的研发带来了新的思路。随着临床对前列腺癌发生发展机制的深入探索，涌现了一大批潜在的治疗靶点，围绕这些靶点开发靶向药物有望进一步改善前列腺癌患者的生存预后。然而，基础研究成果想要成功转化并应用于临床实践，还有很长的路要走。

前列腺癌是典型的雄激素依赖性肿瘤，雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy，ADT）是前列腺癌治疗的基石，也是各种联合治疗方案的基础。以曲普瑞林为代表的ADT药物可强效降低前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）水平并深度降低睾酮水平，为前列腺癌患者带来显著获益。南非一项开放标签、非比较、多中心，III期注册试验[2]，纳入了120例晚期前列腺癌患者，间隔24周连续两次肌内注射曲普瑞林6月剂型。基线时测量睾酮水平，然后每4周复查一次。结果显示，患者接受曲普瑞林6月剂型治疗29天时，97.5%的患者睾酮可达到去势水平（睾酮≤50 ng/dL），且在第2-12个月治疗期间93.0%的患者可维持去势状态；同时，在患者接受曲普瑞林6月剂型治疗第1天、第12、24、36和48周时检测PSA，结果显示，在第6个月和治疗结束时，患者中位PSA相对于基线时分别降低97%和96%[2]此外，曲普瑞林6月剂型在改善患者治疗便利性和依从性等方面的优势使其更受临床医生和患者的青睐。法国的一项为期1年的前瞻性观察研究分析了1438例前列腺癌患者接受促黄体激素释放激素激动剂（luteinising-hormone releasing hormone agonist，LHRH-a）治疗第3、第6和第12个月时的医生处方及患者偏好[3]。结果显示，初始使用6月剂型治疗的患者比例（n=903，62.8%）高于初始使用3月剂型治疗的患者比例（n=535，37.2%），治疗12个月后，71%的患者维持原有治疗方案。共201例患者在随访期间变更了治疗方案，其中170例（84.6%）患者从初始使用3月剂型更换为6月剂型，医生选择处方6月剂型最常见原因是“治疗方案简化”（86.9%）和“减少不必要的就诊”（46.8%）[3]。

作为代表性ADT药物之一，曲普瑞林在前列腺癌领域累积了丰富的循证医学证据和使用经验，如今更是兼具1月、3月、6月三种不同的剂型，为前列腺癌患者带来丰富、灵活的治疗选择。临床医生应综合考虑患者疾病特征、个体状况与需求等因素，为前列腺癌患者制定个体化治疗策略，同步提高患者的生存获益及生活质量。

专家简介

刘建业教授

中南大学湘雅三医院

中南大学湘雅三医院泌尿外科副教授

临床医学博士，博士研究生导师

“湖南省科技创新领军人才”

湖南省“杰青”基金获得者

湖南省“优青”基金获得者

“湖湘青年英才”

“湖南省卫生健康高层次人才”