摘要：软骨修复仍是再生医学中的一大挑战。类器官是由干细胞或祖细胞定向分化而来的微型3D组织结构，能够模拟天然器官的结构与功能。因此，构建软骨类器官（CO）作为一种软骨修复的新策略，展现出巨大潜力。
软骨修复仍是再生医学中的一大挑战。类器官是由干细胞或祖细胞定向分化而来的微型3D组织结构，能够模拟天然器官的结构与功能。因此，构建软骨类器官（CO）作为一种软骨修复的新策略，展现出巨大潜力。
上海大学转化医学研究院苏佳灿团队的研究采用数字光处理系统，对负载骨髓间充质干细胞（BMSC）的DNA-丝素蛋白（DNA-SF）水凝胶缓释系统（DSRGT）进行三维生物打印，构建毫米级CO。
对不同发育阶段的CO进行了表征，并从中筛选出软骨表型最佳的类器官，用于大鼠关节软骨缺损模型中的体内软骨修复。体内实验中，4周CO中的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路被上调，从而在8周内实现了软骨修复。
文章介绍
题目：使用基于DNA-SF水凝胶缓释系统的软骨类器官加速软骨再生
杂志：Mil Med Res
影响因子：22.9
发表时间：2025年7月
#1
研究背景
Background
骨关节炎（OA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征为关节软骨的退化，是全球导致成年人残疾的主要原因之一，给患者及社会带来巨大的经济负担。目前迫切需要开发新技术与新方法来应对软骨修复所面临的挑战。
类器官是由干细胞或祖细胞定向分化而来，能够展现出天然器官的结构与功能特征。它们还具备自我更新和自我组织的能力。与生物材料相比，软骨类器官（CO）不依赖于内源性细胞的募集与增殖，有望加速软骨修复过程。
目前，构建CO最常用的方法包括无支架自组织法与生物材料共培养法。与生物材料共培养能够形成类似于软骨细胞外基质（ECM）的3D网络结构，有助于支持软骨细胞的增殖并维持其生理功能。利用DNA-丝素蛋白水凝胶制备微球，并通过修饰精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽段，被用作构建CO的支架材料。
葡萄糖胺能够刺激BMSC产生类似于天然软骨的ECM，并维持软骨细胞及软骨ECM的稳定性。TD-198946是一种噻吩-苯并咪唑衍生物，是一种高效的成软骨剂。AC-PEG-NHS是一种基于双功能酯的共价交联剂，能够将葡萄糖胺和TD-198946共价接枝到DNA-SF水凝胶上。
该研究采用AC-PEG-NHS，将葡萄糖胺和TD-198946共价锚定在DNA-SF水凝胶网络中。旨在增强DNA-丝素蛋白水凝胶的功能性，使其能够支持BMSCs的持续软骨分化、促进ECM合成，并在长期培养过程中防止去分化和肥大化。这些特性有望促进长期培养且成熟的CO的形成。
通过整合数字光处理（DLP）3D生物打印技术，制备出毫米级CO。本研究旨在探究CO在软骨缺损修复中的作用机制，并分析修复后由CO再生的软骨与健康软骨之间的差异。
图形摘要
#2
研究关键点
Key Points
1. 构建DNA-丝素蛋白水凝胶缓释系统及优化：控制交联程度、孔隙率、生物相容性等因素；
2. 培养软骨类器官：将培养好的软骨类器官与DNA-SF水凝胶缓释系统进行结合，使细胞能够更好地保持其软骨表型，并且水凝胶中缓释的因子能够直接作用于软骨类器官中的细胞，加速软骨类器官的成熟和功能完善；
3. 体内移植与软骨再生评估：组织学分析、生化分析、影像学检查等。
#3
研究结果
Results
新研发的水凝胶缓释系统（DSRGT）由两个网络组成，第一个网络是由RGD修饰的DNA-丝素蛋白水凝胶（DSR）构成，该水凝胶通过共价键接枝了Glu和TD-198946；第二个网络是基于Y型支架单链DNA和L型连接链单链DNA的DNA超分子网络（图1a）。
图1
在365 nm紫外光照射30秒后，DSR和DSRGT均成功形成了水凝胶（图1b）。
图1
¹H核磁共振谱图证实Glu和TD-198946通过AC-PEG-NHS成功实现了双键修饰。随后采用傅里叶变换红外光谱对DSR、含Glu的DSR（DSRG）、含TD-198946的DSR（DSRT）以及含Glu及TD-198946的DSRGT进行了分析，结果显示DSRG和DSRGT在1090 cm⁻¹处的吸收峰显著减弱；TD-198946分别于970 cm⁻¹和1330 cm⁻¹处显示出明显的吸收峰，证实其已成功掺入材料中。
通过场发射扫描电子显微镜观察了DLP系统打印后经冷冻干燥处理的球体所有组别（DSR组、DSRG组、DSRT组、DSRGT组）的球体均呈现出多孔的表面结构（图1g）。四组水凝胶均呈现出均匀的多孔结构（图1h），水凝胶均匀的多孔结构为细胞迁移与黏附提供了良好的微环境。
图1
此外，共价接枝显著延长并控制了释放过程，确保了营养物质在较长时间内的缓慢、均匀释放。这种缓释特性延长了营养供应的持续时间，从而支持了CO的长期培养。
为评估DSR、DSRG、DSRT和DSRGT水凝胶的体外生物相容性，将BMSC接种于各水凝胶上进行共培养。此外，还将前体溶液与BMSC混合，并通过DLP系统打印成负载细胞的水凝胶微球，进行为期5天的共培养（图2a）。
图2
所有组中BMSC均表现出较高的存活率，死亡细胞极少，且各组之间的活/死比例无显著差异。从第1天到第5天，DSR、DSRG、DSRT和DSRGT组中BMSC均表现出显著的增殖，且各时间点之间无显著差异，证实了所有水凝胶组均具有优异的生物相容性。
培养12 h后，DSRGT组显著提高了BMSC的迁移率，高于其他组别。这些结果表明，DSRGT作为3D培养系统中构建CO的理想材料具有巨大潜力。
接下来探究DSR、DSRG、DSRT和DSRGT水凝胶对BMSC软骨分化的影响。在培养7天和14天后，DSRG和DSRGT组的染色强度显著高于其他组（图3a）。这种差异在14天时尤为明显，在软骨分化过程中，DSRG和DSRGT组中糖胺聚糖（GAG）的合成更为显著，这一结果归因于Glu。
图3
DSRG组和DSRGT组在第14天的GAG、Col II含量较第7天有所升高，且这些水平显著高于其他各组。这一增长归因于TD-198946。在第7天和第14天，DSRG组和DSRGT组中ACAN mRNA水平显著高于其他各组。DSRT组和DSRGT组中Col II mRNA表达也显著升高，而Col I和Col X mRNA水平则保持较低，这一结果归因于TD-198946，该化合物在软骨分化过程中有效抑制了纤维化和肥大进程。
DSRGT组在第14天时SOX9 mRNA表达显著增加，在所有组中达到最高水平。与其他组相比，DSRGT组中ACAN、Col II和SOX9的蛋白表达均为最高。因此，选择DSRGT作为CO培养的支架材料，并用于后续实验。
对培养2周、4周和6周的CO进行了系统评估，随着培养时间的延长，类器官逐渐塌陷（图4a）。进一步评估形态学变化，第2周类器官表面细胞层相对致密；第4周细胞在表面扩展，形成多层结构；第6周类器官表面呈现出类似组织的结构（图4b）。
图4
CO中细胞均匀分布在凝胶支架内。第2周和第4周细胞在凝胶内部形成了类似组织的结构；第6周在凝胶内部观察到了由细胞凋亡引起的空泡。CO在4周时的阿利新蓝染色强度高于2周和6周，表明GAG含量在4周时达到最高（图4c）。番红O/固绿染色显示，培养2周、4周和6周的类器官中均呈现软骨特异性的红色染色，证实了CO的成功形成，4周时CO的表型最接近软骨组织（图4d）。
图4
免疫荧光染色分析2周、4周和6周类器官中软骨特异性标志物相关的标志物的表达情况（图4e）。结果显示，Col II、Col I和Col X表达在6周时达到高峰。在2周和4周时，Col X的表达相对较低。在4周后，TD-198946完全释放，导致Col I和Col X表达显著上升。此外，ACAN表达在4周时最高，这与此时Glu几乎完全释放的时间点相吻合。
总体而言，培养4周后的CO表型最接近透明软骨，展现出最为理想的软骨特异性特征。
图4
对体外培养0、2、4和6周的BMSC进行高通量mRNA测序（即0W、2W、4W和6W组）。主成分分析显示， 0W、2W、4W和6W组之间的基因表达谱存在显著差异，而每组内部的基因表达谱则较为相似。
差异表达基因（DEG）的数量呈现先增加后减少的趋势：从0周与2周组之间的2585个差异表达基因，增加到2周与4周组之间的4886个差异表达基因，随后又减少到4周与6周组之间的1785个差异表达基因，表明最显著的基因表达变化发生在分化的早期阶段（2-4周）。在晚期分化阶段（4-6周），显著下调的DEG数量高于显著上调的差异表达基因。
维恩图分析鉴定出在CO发育所有阶段持续表达的311个差异表达基因。此外，与0周组相比，在所有时间点共鉴定出1796个共享的差异表达基因。在最初4周内，与软骨分化相关的基因逐渐上调，在第6周时趋于稳定或进一步升高。然而，与软骨纤维化和肥大化相关的基因在第6周时表达水平达到最高（图5d）。
图5
此外，关键的软骨生成基因Acan以及与增殖相关的基因Gli1在前4周保持稳定，但在第6周显著下降。KEGG通路富集分析揭示了软骨球发育过程中DEG的功能作用。因此，选择培养4周的类器官进行后续的体内验证实验。
通过大鼠膝关节软骨缺损模型（缺损尺寸0.2×0.2 mm）评估了培养4周的CO的再生潜能（图6a）。假手术组的软骨表面光滑且均匀；对照组显示出修复的软骨不规则，表面有凹陷，缺损边缘模糊，周围软骨出现退行性改变；DSRGT组的修复组织较为平滑且更均匀，但厚度较薄；CO组展示了最佳的修复效果，缺损被良好填充，表面光滑，周围软骨无退化，与天然软骨形态相似（图6b）。
图6
CO组中的表面粗糙度（Ra）略高于假手术组，但差异无统计学意义，且这些值显著低于对照组和DSRGT组。总体而言，CO组在软骨修复方面表现更优，且未出现显著的全身毒性反应。
与损伤软骨相比，CO组与健康软骨之间存在80个共有DEG；而与健康软骨相比，CO组与损伤软骨之间有20个共有差异表达基因，这表明CO组的基因表达谱更接近于健康软骨，而非损伤软骨。
与受损软骨相比，CO组显示出230个显著上调的基因和93个显著下调的基因。与健康软骨相比，CO组显示出100个上调基因和78个下调基因。这些基因在CO组中呈现更显著的上调表达。
GO分析表明，CO组中的再生软骨上调了与软骨基质合成相关的通路。KEGG分析显示，CO组中的再生软骨也上调了MAPK信号通路。基因集富集分析和通路基因热图结果进一步支持了这些发现。
CO组中p-p38、p-ERK和p-JNK的表达水平显著升高，表明通过上调MAPK信号通路，CO组促进了软骨再生。CO组与健康组样本之间的基因表达谱相对相似。仅有3个转录因子家族呈现差异表达，分别为锌指C2H2型（zfC2H2）、甲状腺激素受体样（THR-like）和叉头框（Forkhead）家族。
小结
该研究开发了一种新型缓释系统——DSRGT，用于支持CO的长期培养。通过DLP技术，成功制备了毫米级CO。该策略促进了BMSC的成软骨分化，并在长期培养过程中抑制了其纤维化和肥大化进程。
进一步研究了软骨球的发育过程，确定4周为构建透明样CO的最佳时间点。此外，移植CO能够通过上调MAPK信号通路促进软骨再生。
综上所述，利用DSRGT构建的CO为软骨缺损修复提供了一种新颖而高效的策略。
参考文献
Shen CY, Zhou QR, Wu X, Han XY, Zhang Q, Chen X, Lai YX, Bai L, Jing YY, Wang JH, Wang CL, Geng Z, Su JC. Accelerating cartilage regeneration with DNA-SF hydrogel sustained release system-based cartilage organoids. Mil Med Res. 2025 Jul 28;12(1):39. doi: 10.1186/s40779-025-00625-z.
来源：培养盒守护者