摘要：相位信息表征了光波通过样品传播而被延迟的程度。然而，光探测器只能测量光波的强度变化，导致相关相位信息的丢失，因而诞生了“相位问题”。这个术语起源于晶体学领域，其中相位问题需要解决，以确定衍射测量晶体的结构。叠层扫描法最初是在1969年开发的，以解决电子的相位问
相位信息表征了光波通过样品传播而被延迟的程度。然而，光探测器只能测量光波的强度变化，导致相关相位信息的丢失，因而诞生了“相位问题”。这个术语起源于晶体学领域，其中相位问题需要解决，以确定衍射测量晶体的结构。叠层扫描法最初是在1969年开发的，以解决电子的相位问题。晶体学通过测量衍射数据作为一个狭窄的相干探测光束平移通过晶体样品，它旨在提取晶体的布拉格峰的相位-由晶格散射引起的干涉最大值-从而恢复晶体结构的真实空间图像。（发音为tie-KOH-gra-fee）源自希腊语ptycho，在英语中表示折叠，在德语中表示卷积。选择该词是为了突出探测光束与晶体样品之间的空间域相互作用，虽然叠层扫描成像的实验和计算实现自其诞生以来已经发生了很大的变化，但倒易空间中的卷积仍然是该技术的一个关键方面，并且该名称至今仍然适用。
自1969年概念化以来，经过几次发展，叠层扫描成像技术才成为一种实用且吸引人的成像技术。其中一个显著的进步是采用迭代相位恢复框架进行图像重建，这将该技术带到了现代形式。实验过程保持不变：被测物体通过空间受限的探测光束平移，并在倒易空间中记录相应的衍射图案（图1a）。然而，与原始概念不同的是，原始概念使用了分析反演方法，
该方法需要大量测量，而现代叠层扫描成像通过施加两组约束从基本上较小的数据集迭代地恢复对象。在真实的空间中，对象通过探测光束的平移导致对象表面上重叠照明区域的拼凑，并且重构的对象图像必须在这些重叠区域中是一致的。在倒易空间中，衍射测量用作对重建的物体图像的约束，其傅立叶变换必须与探测光束的每个位置的测量衍射数据相匹配。图1b、c中的叠层扫描成像的迭代重建过程基本上寻找满足两个约束的物体估计。如图1b的右图所示，在相邻测量期间，照明的重叠区域是叠层扫描法相对于其它相位恢复方法所提供的关键创新，因为它既避免了解决方案中的模糊性，又加速了相位恢复过程的收敛速度。
在迭代相位恢复框架的帮助下，叠层扫描已经发展成为一种使能显微技术，其中成像光学器件被计算重建所取代。在过去的几十年中，叠层扫描已经引起了不同研究团体的相当大的关注。对于相干X射线成像，它已成为世界上大多数同步加速器和国家实验室不可缺少的成像工具。对于电子显微镜，最近的工作已经将成像分辨率推到了破纪录的深亚埃水平。对于可见光成像，空间域和傅立叶域叠层扫描成像的新发展为高分辨率提供了独特的解决方案，以最小的硬件修改实现高通量光学成像。
为了促进不同领域的生物医学研究人员对叠层扫描的吸收，在这里，该文提供了一个全面的协议，详细介绍了可见光区域中空间域编码叠层扫描(CP)和傅立叶域叠层扫描(FP)的实现。该文提出了替代方法，检查了不同叠层扫描实现的优点和局限性，并识别实验过程中可能出现的关键步骤和陷阱。具有光学和编程基本经验的用户可以在大约1周内完成设置并执行叠层扫描重建。您自己的设置性质也允许该协议在与傅立叶光学，生物医学仪器，数字图像处理，机器人和顶点设计项目相关的实验室课程中实施。
FP（傅里叶叠层成像）和CP（编码叠层成像）是基于现代形式的叠层扫描技术而设计的两种变体，旨在实现高分辨率，可见光高通量成像。FP方法于2013年开发，用于将常规透镜显微镜的分辨率提高到物镜设置的衍射极限之外10。典型的FP设置包括可编程发光二极管(LED)图2中的系统配置为FP设置定义了三个平面：物平面(x, y)处的样本、傅立叶平面(kx, ky)处的光瞳孔径和像平面(x)，物镜透镜执行傅立叶变换以将来自物平面(x, y)的光波转换到孔径平面(kx, ky)。管透镜执行第二次傅立叶变换以将来自透射镜的光波转换为透射镜的光波。在该成像模型中，傅立叶平面中的光瞳孔径有效地用作用于像平面中的测量的低通滤波器。
FP和CP之间的内在联系在图2的“成像模型”和“操作”部分中进行了总结。使用FP，物体位于真实的空间，两个光学透镜将其转换到倒易空间，然后再转换回真实的空间。瞳孔孔径在傅立叶平面中充当有效的叠层扫描探测器。使用CP，物体位于真实的空间，CP中的血液涂层作为调制平面上的有效叠层扫描探测器，该文可以看到FP中的两个傅里叶变换操作被两个自由的傅里叶变换操作所取代，这两个自由的傅里叶变换操作可以在CP中的血液涂层上实现。CP中的空间传播操作。FP和CP都使用覆盖大面积图像采集的扩展光束照射样品。这是高通量显微成像的关键考虑因素。FP和CP之间的一个区别是使用的光源：FP使用低相干LED，CP使用激光。这种差异可以通过系统的时间相干性要求来解释。使用FP，色散可以通过显微镜的透镜部分补偿：具有小光谱带宽的光（对于LED约为15 nm）可以被带到相同的像平面。另一方面，在CP中，不同波长的光在自由空间传播后会分散到不同的轴向平面。因此，CP对光源的时间相干性有更严格的要求，单色激光器是更合适的选择。然而，在CP实验中，也可以将LED光源捕获的图像建模为相干态混合29，30。
该方案的总体工作流程如图3所示：左侧面板中的程序1涵盖FP系统，右侧面板中的程序2涵盖CP系统。FP系统的程序1从开发可编程光源开始（程序1）。该文讨论光源的两种设计：（1）用小间距表面安装元件构建的定制平面LED矩阵，以及（2）用现成的LED矩阵构建的组装平面LED阵列。接着，将光源模组贴附在一个普通的光学显微镜上进行系统整合。在适当对准LED光源的情况下，该文讨论校准不同LED元件的入射角的两种选择（第一种选择依赖于亮场到暗场的转换。暗场转换特征，并可用于校准具有明确定义的网格图案的LED矩阵第二种选择是将校准目标放置在散焦平面处，并使用高NA物镜透镜来获取在不同LED元件的照明下的一组图像。第二种角度校正方法可用于任何平面LED照明器。接下来，该文校正物镜透镜的光瞳像差。在该过程中，以血涂片为标定对象，在不同LED元件照明下采集一组图像，并将瞳孔像差与标定联合恢复一旦系统被完全校准，FP成像实验可以针对不同的生物样本运行。采用两种方法来缩短采集时间：(1)根据照度NA应用不同的相机增益;(2)在采集过程中跳过部分LED元件。
CP系统的程序2从在图像传感器上制备血细胞层开始（程序2）。在传感器上形成致密均匀的单层山羊血细胞可以获得良好的CP成像结果。接下来，讨论用于传感器平移的电动载物台的开发。用低成本三维步进电机代替x和y手动驱动器。一旦硬件开发完成，描述了使用血液涂片载玻片作为校准对象的系统校准。该校准过程的目标是恢复图像传感器上的血细胞编码层的透射轮廓。该文将编码传感器扫描到不同的横向位置，并获取相应的图像，用于编码层和校准对象的联合恢复。使用迭代相关分析方法获得编码传感器的位置偏移。利用恢复的编码层轮廓，然后可以对不同的生物样本进行CP成像实验。
叠层扫描成像由于其在可见光范围内有限的分辨率和通量，仍然没有被生物医学研究人员充分利用。空间和傅立叶域叠层扫描成像的最新发展已经成功地解决了这些问题，现在提供了高分辨率，高通量光学成像的潜力，对现有的显微镜设置进行最小的硬件修改，通常在传统成像系统固有的分辨率和视场之间提供极好的折衷，使生物医学研究人员两全其美。在这里，该文提供了广泛的信息，以使生物医学研究人员能够在可见光范围内实现叠层扫描成像。该文首先讨论了空间域编码叠层扫描和傅立叶叠层扫描之间的内在联系。然后，一步一步的指导提供了用户使用实际例子开发这两个系统的说明。在空间域实现中，该文解释了如何以微不足道的成本制造大规模、高性能的血细胞透镜。在傅立叶域实现中，该文解释了如何在普通显微镜上添加低成本的光源，以提高分辨率，使其超出物镜透镜的限制。
科学技术的发展离不开科研仪器的进步。凯视迈（KathMatic）自2014年创建以来，一直“致力于高精尖光学测量技术”，已成为集“研发、制造、销售”为一体的国产高端光学精密测量仪器新力量。推出了KC系列多功能精密测量显微镜、KS系列超景深3D数码显微镜以及KV系列激光多普勒测振系统，取得了良好的市场成绩。详情欢迎留言咨询!
来源：凯视迈精密测量
