摘要：WHO中枢神经系统肿瘤新分类强调了分子特征在肿瘤诊断及预后方面的作用。对IDH突变型星形细胞瘤的研究显示，CDKN2A/B基因的纯合性缺失与不良预后相关。CDKN2A/B基因位于染色体9p，编码抑癌蛋白p16（INK4A）、p14（ARF）和p15（INK4B
WHO中枢神经系统肿瘤新分类强调了分子特征在肿瘤诊断及预后方面的作用。对IDH突变型星形细胞瘤的研究显示，CDKN2A/B基因的纯合性缺失与不良预后相关。CDKN2A/B基因位于染色体9p，编码抑癌蛋白p16（INK4A）、p14（ARF）和p15（INK4B），它们都是细胞周期的关键调控分子。2021年WHO中枢神经系统肿瘤分类（WHO CNS 5）对IDH突变型星形细胞瘤的更新要点之一是，无论组织病理学分级如何，存在CDKN2A/B纯合性缺失的肿瘤均归为WHO 4级。然而目前还没有成熟的分子标志物区分IDH突变的2级和3级星形细胞瘤。
近期对GLASS数据库的分子表明，CDKN2A/B杂合性缺失与IDH突变型星形细胞瘤较差的总生存期相关。另一项基于单核苷酸多态性（SNP）的研究中，发现非同义CDKN2A突变、CDKN2A/B杂合性缺失、PDGFRA扩增和CDK4扩增与较短的生存期相关。然而该研究纳入了复发的WHO 4级星形细胞瘤。由于CDKN2A/B的评估结果因所选研究方法和队列的不同会产生显著的差异，因此本研究的主要目的是评估新诊断WHO 2级和3级IDH突变型星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤CDKN2A/B杂合性缺失的情况，及其与预后的影响。
研究方法
1、组织样本与患者数据
本研究收集了自1994年至2022年确诊为星形细胞瘤（IDH突变，WHO 2级、3级和4级）和少突胶质细胞瘤（IDH突变，1p/19q共缺失）的组织样本。根据WHO CNS 5，上述肿瘤被归为WHO 2级和3级肿瘤。排除复发肿瘤。若患者临床信息完整，则获取石蜡包埋样本。临床信息包括：人口统计学、病理学诊断、CNV分析结果、IDH突变状态、ATRX突变状态、MGMT启动子甲基化、CDKN2A/B状态。
2、组织学与分子分析
对所有病例的HE染色进行组织学复核。通过免疫组化法检测ATRX状态。对所有患者的石蜡包埋样本进行DNA甲基化分析。基于DNA甲基化分析生成的拷贝数图谱，对每个样本的CDKN2A/B位点进行人工测定，通过染色体图谱中全染色体（或大片段）缺失/增益确定纯合性缺失或杂合性缺失。如果CDKN2A/B位点与一条染色体缺失或增益处于同一水平，或CDKN2A/B缺失的深度与同一样本单拷贝染色体缺失的深度相当，则定义为杂合性缺失。如果CDKN2A/B位点与染色体缺失或增益距离基线的距离是一条染色缺失或增益的两倍，则定义为纯合性缺失。如果超过50%的9p染色体臂缺失，则定义为包含CDKN2A/B的杂合性片段缺失。
为了在独立的队列验证研究结果，使用cBioPortal分析了TCGA中的两个独立队列的合并数据。仅包含存在IDH1或IDH2突变，TP53和/或ATRX突变，以及1p/19q完整的病例，且排除甲基化类别为“少突胶质细胞瘤，IDH突变，1p/19q非共缺失”的样本。最终得到209例患者的样本，CDKN2A/B状态的评估方法同前。
研究结果
1、基线特征
在海德堡神经病理学研究所数据库中，共有13.5万例患者的甲基化信息，其中有9092例诊断为IDH突变型星形细胞瘤和IDH突变，1p/19q共缺失的少突胶质细胞瘤。筛选后共有334例复核条件，其中173例星形细胞瘤，161例少突胶质细胞瘤。共纳入了42例WHO 4级的星形细胞瘤，以重复评估CDKN2A/B状态。纳入标准详见图1（略），基线特征见表1。
表1：患者的基线特征
2、WHO 2级和3级IDH突变型星形细胞瘤CDKN2A/B杂合性缺失与预后的关系
在WHO 2级和3级IDH突变型星形细胞瘤中，共37例存在CDKN2A/B杂合性缺失，与野生型相比，CDKN2A/B杂合性缺失并未导致更差的OS（p=0.2556，风险比2.29）和PFS（p=0.128，风险比1.58）。无论是2级或3级肿瘤，上述结果均无统计学差异（图2-3）。另外，Cox风险模型显示在WHO 2级和3级IDH突变型星形细胞瘤中，CDKN2A/B杂合性缺失不存在更显著的死亡风险。
另外，本研究分析了IDH突变且既往组织病理学分级为4级的星形细胞瘤。在42例肿瘤中，8例存在CDKN2A/B杂合性缺失，它们与不存在CDKN2A/B缺失的肿瘤的OS没有显著差异（p=0.168）。另外，存在CDKN2A/B纯合性缺失的肿瘤与不存在CDKN2A/B缺失的肿瘤相比OS缩短（p=0.049）。Cox风险模型显示，在WHO 4级肿瘤中，存在CDKN2A/B杂合性缺失的肿瘤死亡风险增加，但无统计学意义。而CDKN2A/B纯合性缺失与死亡风险增加显著相关。
图2：CDKN2A/B野生型和杂合性缺失型WHO 2-3级星形细胞瘤的OS（绿色：杂合性缺失型，紫色：野生型）。A：WHO 2级和3级肿瘤；B：WHO 2级肿瘤；C：WHO 3级肿瘤。
图3：CDKN2A/B野生型和杂合性缺失型WHO 2-3级星形细胞瘤的PFS（绿色：杂合性缺失型，紫色：野生型）。A：WHO 2级和3级肿瘤；B：WHO 2级肿瘤；C：WHO 3级肿瘤。
3、少突胶质细胞瘤CDKN2A/B缺失与预后的关系
在少突胶质细胞瘤中，CDKN2A/B缺失与预后的关系被持续研究。本研究中，CDKN2A/B杂合性缺失患者（n=15）的OS（p=0.276）和PFS（p=0.305）与未缺失患者类似（图4-5）。且无论WHO分级如何，生存结果无统计学差异。在本研究中，没有WHO 2级少突胶质细胞瘤存在CDKN2A/B纯合性缺失，在WHO 3级肿瘤中，仅有3例存在纯合性缺失。但这些病例的PFS较短（p=0.0257），OS有缩短趋势（p=0.0631）。
图4：CDKN2A/B野生型和杂合性缺失型WHO 2-3级少突胶质细胞瘤的OS（绿色：杂合性缺失型，紫色：野生型）。A：WHO 2级和3级肿瘤；B：WHO 2级肿瘤；C：WHO 3级肿瘤。
图5：CDKN2A/B野生型和杂合性缺失型WHO 2-3级少突胶质细胞瘤的PFS（绿色：杂合性缺失型，紫色：野生型）。A：WHO 2级和3级肿瘤；B：WHO 2级肿瘤；C：WHO 3级肿瘤。
4、基因位点或片段缺失与预后的关系
在本研究中，少部分CDKN2A/B杂合性缺失表现为位点的缺失，而其他病例表现为大片段的缺失。与不存在CDKN2A/B缺失的病例相比，无论是位点缺失或节段性缺失，OS均无差异。但样本量较小，无法得出有效的结论。
5、采用标准化数值评估缺失CDKN2A/B情况以及预后
将log2拷贝数比率≤-1.1定义为CDKN2A/B纯合性缺失，将-1.1＜log2拷贝数比率＜-0.4定义为杂合性缺失。根据这种定义进行分组，导致CDKN2A/B无缺失患者数量减少，CDKN2A/B杂合性缺失数量增加。但杂合性缺失患者的OS并无缩短。而纯合性缺失与显著较短的OS相关。Cox风险模型也显示CDKN2A/B杂合性缺失患者的死亡风险无显著增加。
6、海德堡和TCGA数据库中基因扩增、甲基化谱和CNV的特征分析
对CDK4、CDK6、CCND1、CCND2以及PDGFRA扩增的研究显示，海德堡数据库中，依据CDK4/6扩增、PDGFRA扩增、甲基化肿瘤分型和拷贝数变异负荷进行分层，可导致死亡风险增加，OS缩短。相比之下存在CCND1/2扩增与较差的OS无关。在TCGA的验证队列中也能重复此发现。对于CDKN2A/B杂合性缺失和纯合性缺失对预后的影响，也可以被重复。有趣的是与位点缺失相比，CDKN2A/B片段缺失的OS更差。同样，CDK4/6扩增以及甲基化肿瘤分型进行分层，导致OS缩短。但与海德堡数据库相反，TCGA中CCND1/2扩增导致OS缩短。而PDGFRA扩增和拷贝数变异负荷与OS无关。
7、DNA微阵列芯片分析支持研究队列中CDKN2A/B状态与预后的关系
研究者还探索了WHO CNS 5分类、CDKN2A/B状态以及甲基化分型之间的关系。在研究队列中，被诊断为WHO 2级和3级少突胶质细胞瘤，以及WHO 2级和3级星形细胞瘤，且无CDKN2A/B缺失或杂合性缺失的病理主要归为“少突胶质细胞瘤或星形细胞瘤，IDH突变，低级别”。相应地，一组病理被诊断为WHO 4级星形细胞瘤，被归为“星形细胞瘤，IDH突变型，高级别”这一甲基化分组。这说明CDKN2A/B状态与肿瘤的分级相关，并且突出了CDKN2A/B杂合性缺失与预后的关系。在CDKN2A/B杂合性缺失的病例中（n=60），根据甲基化谱，24例归为“星形细胞瘤，IDH突变，低级别”，15例归为“少突胶质细胞瘤，IDH突变和1p/19q缺失”，仅有21例归为“星形细胞瘤，IDH突变，高级别”。而CDKN2A/B纯合性缺失的病例中（n=22），18例归为“星形细胞瘤，IDH突变，高级别”。
讨论与结论
对于CDKN2A/B杂合性缺失的准确检测具有挑战性，而且不同的研究方法可能得出不同的结果，因此影响预后的预测。拷贝数的数值在很大程度上取决于样本中肿瘤细胞的纯度，既往研究通常将log2拷贝数比率≤-1.1定义为纯合性缺失，将-1.1＜log2拷贝数比率≤-0.4定义为杂合性缺失。本研究中，若按照上述分类方法，既往被定义为纯合性缺失的部分病例会变为杂合性缺失。因此本研究是通过DNA甲基化分析生成的拷贝数图谱人工确定CDKN2A/B位点并加以判断。通过上述方法，在WHO 2级和3级星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤中，CDKN2A/B是否存在杂合性缺失与OS和PFS无关。按照WHO 分级进行分层分析，结果亦是如此。然而正如近期研究所强调的那样，肿瘤内部存在异质性，可能出现新的亚克隆纯合性缺失，这些因素可能导致不同研究中对CDKN2A/B杂合性缺失与预后的关系存在差异。
另外，在一组组织学诊断为WHO 4级的IDH突变型星形细胞瘤中，也可以验证本研究所用的方法。来自TCGA的独立数据也可验证结果。这表明对甲基化谱、CDKN2A/B状态和非整倍体的综合评估提供了比组织病理学分级更优的预后分析，并为患者提供了更完善的个体化风险评估和治疗计划。
本研究中在少数WHO 3级的少突胶质细胞瘤中，存在CDKN2A/B纯合性缺失，并有预后较差的趋势。但由于样本量过小并未达到统计学意义，需要进一步验证。这些结果与既往发表的来自POLA数据库中的数据一致。同样与该数据库一致的是，在本研究中，未发现存在CDKN2A/B纯合性缺失的WHO 2级少突胶质细胞瘤。这提示对少突胶质细胞瘤进行预后分层时也应考虑CDKN2A/B纯合性缺失的情况。
对CDKN2A/B杂合性缺失对预后影响的研究可能指导未来的治疗决策。如IDH抑制剂vorasidenib已被证实能够显著延长既往未接受治疗的，存在肿瘤残余或复发的WHO 2级IDH突变型胶质瘤。目前开展的研究针对WHO 3级肿瘤，并探索与其他药物如帕博利珠单抗、肿瘤疫苗等药物联用的疗效（NCT05484622，NCT05609994）。因此分子遗传学改变与预后的关系十分重要，这有助于将患者分配至合适的治疗组，并更好解释药物对某些特定亚型患者的疗效。总而言之本研究表明在WHO 2级和3级IDH突变型星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤中，CDKN2A/B杂合性缺失不影响OS和PFS。另外建议通对CDKN2A/B的状态进行人工评估以确定缺失的情况。
参考文献：Franziska M. Ippen et al. The prognostic impact of CDKN2A/B hemizygous deletions in IDH-mutant glioma.Neuro-Oncology.2024.doi: 10.1093/neuonc/noae238.
来源：脑肿瘤化疗张俊平医生
