摘要：2024年12月，南加州大学科研团队在期刊Nature Protocols（IF:13.1）上发表了一篇题为“Generation and long-term culture of human cerebellar organoids from pluripo
文章介绍
2024年12月，南加州大学科研团队在期刊Nature Protocols（IF:13.1）上发表了一篇题为“Generation and long-term culture of human cerebellar organoids from pluripotent stem cells”（利用多能干细胞生成并长期培养人类小脑类器官）的文章。
#1
摘要
Abstract
用于研究大脑发育和疾病的人类类器官模型系统的出现开创了一个新时代，人们可以借此了解以前无法了解的人类早期大脑发育的方方面面。鉴于在这些关键阶段人体组织的有限性，类器官为深入研究以人类特异表型和多基因病因为特征的多种神经发育疾病的复杂遗传学提供了一个强大的平台。
能够模拟类似前脑的区域特征的类器官已经被广泛地建立起来，并与它们的内源性对应物进行了表征和基准测试，为前脑发育和疾病提供了宝贵的见解。然而，针对大脑尾部区域的类似研究却相对较少。这种差异主要源于外胚层聚集体生成端脑结构的内在偏向，这自然使得端脑类器官在人类多能干细胞（hPS）系内部和之间的可重复性更高。然而，包括小脑类器官在内的其他类型类器官亟需优化和彻底表征，特别是考虑到越来越多的证据凸显了小脑在高阶认知功能中的关键作用。有趣的是，这一大脑区域在类人猿支系中的大量进化扩展表明，小脑可能在人类特异性状的获得过程中发挥了作用。值得注意的是，研究表明人类菱形唇具有人类特有的室下区，这是小鼠和其他灵长类动物所没有的；最近的研究表明，人类浦肯野细胞表现出独特的发育动态，与其他物种相比，早期出生的亚型扩大。
本文介绍了生成 hPS 细胞衍生的人小脑类器官（hCerO）模型的详细方案。这些类器官能够再现胎儿小脑复杂的细胞多样性，组织成层流程，并表现出体内小脑所特有的分子和电生理特征。hCerO有望增强我们对人类小脑对大脑发育、功能和疾病的独特贡献的理解。
图1 | hCerO分化时间线。a，干细胞第0天分离和镀板启动hCerO分化的时间线。b，从第0天（d0）到第60天（d60），小脑诱导时间和生成hcero的模式方案以及关键发育阶段、细胞身份和培养条件。NE神经上皮；PC，浦肯野细胞；GC、颗粒细胞、PIP、PAX2+中间神经元祖细胞；UBC，单极刷细胞；iCN/eCN，抑制性和兴奋性小脑核；ROCKi，Y-27632-ROCK抑制剂；SB，SB431542-TGF-β抑制剂；Noggin，BMP抑制剂；CHIR，CHIR99021-GSK3抑制剂；CerDM1/2/3，小脑分化中度1/2/3。
#2
预期结果
Results
本方案旨在生成包含胎儿小脑细胞多样性的小脑类器官，并可长期培养以实现抑制性和兴奋性神经元群的功能成熟。这种方法很容易在各种hPS细胞系中应用，它们必须以最佳形态开始。
在培养的前10天内，类器官的形状和大小会持续增长，显示出神经外胚层分化的迹象，约第6天形成花环结构，保持高圆度和高线性度。若起始的 hPS 细胞显示出分化迹象，由其生成的类器官可能会在分化的前 10 天内显示出小叶结构，这表明分化出现了问题，必须通过免疫荧光分析确认。在第 16 天转移到 10 cm培养皿后，类器官的大小和圆度应基本一致。
此时，类器官通常看起来不透明且呈圆形，必须培养到 30 天后才能确定分化是否成功。在分化过程的第 30 天，可能会出现半透明的花环状神经上皮结构，表明神经诱导成功。然而，需验证发育中小脑的典型祖细胞类型（ATOH1 和 KIRREL2）及其各自的神经元祖细胞（BARHL1 和 SKOR2）是否存在以确认小脑命运分化成功（图2、 3a,b）。
图2| hcero生长最优（左）和次优（右）的亮场图像。a，无饲喂器条件下培养的hiPS细胞群的代表性图像。请注意，理想集落大且分布稀疏，没有中央或周围分化的证据。b， 96孔v型底板中精确酶解离和再聚集后EB形成2 d的代表性图像。注意，EB没有大量的细胞围绕在中央聚集体周围，随着时间的推移不应该形成小叶结构。标尺，200 μm。c，神经上皮扩张期（16-30天）理想和异常hcero的代表性图像。比例尺，1mm。注意批内理想类器官的大小和形状的一致性。d，成熟阶段（30天后）理想和异常hcero的代表性图像。注意在第30天至第60天这一阶段类器官的生长。比例尺，1mm。
图3 | 30+天ceros的形态学和免疫组织化学特征。a，关键颗粒细胞祖细胞标志物（BARHL1）和有丝分裂后浦肯野细胞标志物（SKOR2）的免疫染色。b，兴奋性菱形唇祖细胞（ATOH1）和心室区祖细胞（KIRREL2）的免疫染色。SOX2染色神经上皮祖细胞。标尺，200 μm。c，通过免疫组化分析评估4个细胞系n = 3个类器官中BARHL1和SKOR2细胞的百分比。d，经过批量校正、比对和典型相关分析（CCA）以及每个定义簇的比例（org1, 4,817个细胞），来自2个月大的hcero的scRNAseq数据的均匀流形近似和投影（UMAP）；组织2:6768个细胞，组织3:3362个细胞)。BG，伯格曼神经胶质；Div,划分;eCN，兴奋性小脑核；GC，颗粒细胞；GCP，颗粒细胞祖细胞；iCN，抑制性小脑核；MLI，分子层中间神经元；PIP， pax2+中间神经元祖细胞；PC，浦肯野细胞；RL，菱形唇形；单刷，单极刷电池；VZ，心室区。
培养1.5个月后，小脑类器官可能发展出更紧密、均匀的半透明花环结构，而小脑花环结构通常不持久。通过免疫荧光染色检测FOXG1等前脑标记物，可确认类器官含有前脑花环。其他关键前脑结构标记包括PAX6+ SOX2+ 花环和TBR1+细胞。将scRNAseq类器官数据与发育中人脑数据比较，以确保 hCerOs 中不存在脱靶细胞，包括前脑细胞，这对准确识别细胞至关重要。若类器官大而不透明，无可见花环，建议切片和染色以检查内部是否存在较小花环（图4）。
图4 | hCerO分化次优结果的形态学和免疫组织化学特征。a，利用tdTOMATO::FOXG1报告细胞系鉴定的含有FOXG1+前脑细胞的次优30天类器官的亮场图像与荧光图像叠加。比例尺，1 mm. b，利用tdTOMATO::FOXG1报告细胞系鉴定的缺乏FOXG1+前脑细胞的最佳第30天类器官的Brightfield图像与荧光图像叠加。比例尺，1 mm.c-e， 20 μm厚的免疫荧光图像，次优60天hCerOs的连续切片，分别用来自FOXG1报告细胞系的内源性tdTOMATO信号染色BARHL1 (c)、PAX6和MAP2 (d)、SOX2和TBR1 (e)。比例尺，200 μm。f，第60天类器官的明场图像，大量脉络膜丛样细胞占据了类器官。比例尺，200 μm。g，用TTR、MAP2和FOXG1染色的20 μm厚的60天次优hCerOs连续切片的免疫荧光图像。比例尺，200 μm。
研究证实了在多种细胞系中重复生成小脑细胞类型的能力，包括iPS细胞系和胚胎干细胞系（H9）。虽然分化批次之间存在差异，但给定批次内的类器官显示出高度的可重复性。H9细胞系特别抵抗小脑尾状分化，可能与其他倾向于产生默认端脑命运的细胞系相似。如果成功，hCerO能够持续产生发育中小脑中的所有细胞类型（图3c,d）。
在培养至第60天时，观察到类器官出现大而光滑的圆形结构，部分区域出现纹理，这通常是脉络丛样结构发育的标志。然而，这一现象可能因细胞系不同而异，且并非培养过程中的特定目标。虽然脉络丛的生成在一定程度上有利于小脑类器官的发育，但若脉络丛比例超过50%，可能会减少小脑细胞的数量（图2d、4f,g）。
通过荧光成像技术GCaMP6f+检测hCerO中的钙动态，以确定其功能特征。通过量化荧光变化（ΔF/F）来监测神经元活动，发现钠通道阻断剂TTX能抑制这些变化，表明神经元活动的存在。比较2个月大和6个月大的hCerO，发现神经元活动随时间增加并呈现成熟特征，体现在每帧平均激活度和每个神经元的平均峰间时间等参数上（图5）。
图5 | hCerO的钙成像分析。a， 2个月和6个月大的hcero的功能特征示意图。b，用SomaGCaMP6f2转导的2个月大的hcero的代表性帧。比例尺，50 μm.c， 2个月hCerO中ΔF/F的代表性痕量。d， 2月龄hCerO应用TTX后ΔF/F的代表性痕迹。e， 6月龄hCerO中ΔF/F的代表性痕量。f， 6个月hCerO应用TTX后ΔF/ f的代表性迹线。g，量化n = 14个2月龄和n = 14个6月龄hcero的每帧平均激活。
在培养第60天，成功分化的迹象包括鉴定出表达CALB1的成熟浦肯野细胞，并表现出独特的树突形态和单树突生长。通过视蛋白激活和LED刺激比较，可以评估浦肯野细胞在网络中的整合和功能。随着浦肯野细胞的成熟，它们在接近6个月的培养过程中表现出树突轴化和复杂性的增加，以及更成熟的浦肯野细胞标记物的表达。空间转录组学检测到更多成熟浦肯野细胞标记物的表达，揭示了成熟诱导动作电位的发射能力，以及自发、超极化激活阳离子电流（Ih）和重复发射的能力。对8个月大的hCerOs中的PCP2+神经元进行的膜片钳记录证实，这些神经元细胞在扩展培养物中能够保持健康和活跃（图6）。
图6 | 浦肯野细胞功能。a，通过IHC鉴定60岁hCerOs中表达CALB1的成熟浦肯野细胞，并表现出独特的树突形态和单个树突生长。标尺，200 μm。b，通过激活opsin L7-eOPN3对浦肯野细胞在网络内整合的功能评估。c， 6个月大的hCerO在基线和LED刺激后的代表性帧。d， 6个月大eOPN3+ hCerOs在基线（n = 3）和LED刺激（n = 8）后记录的钙信号的量化。每个点代表一个类器官。学生配对t检验***P = 0.001。e， 6个月大的hCerO在活体类器官中表达PCP2的成熟浦肯野细胞形态可视化。标尺，200 μm。f，通过6个月大的类器官PCP2+细胞的全细胞贴片记录证实了hCerOs中浦肯野细胞的功能谱。g - j，这些记录揭示了激发成熟诱导动作电位(g)的能力，以及自发(h)， Ih电流(i)和重复动作电位(j)。
关于本研究中实验操作的具体步骤，小学社将在下期推文中为大家详细讲解！
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参考文献
Atamian A, Birtele M, Hosseini N, Quadrato G. Generation and long-term culture of human cerebellar organoids from pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2024 Dec 2. doi: 10.1038/s41596-024-01093-w. Epub ahead of print. PMID: 39623220.
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来源：培养盒守护者