摘要：在 30 L 生物反应器中进行补料分批培养，同时分别改变搅拌速度和表层通气流速作为变量，采用中心复合设计确定它们对抗体滴度的单一影响和交互影响。表 2 总结了 13 组实验中抗体表达水平，范围为 950-1850 mg/L，表明确定最佳工艺条件的重要性。为了评
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【领康时代CDMO】设计 pH 控制策略以提高生物反应器中 CHO 细胞的表达（上篇）
一、基于CCD 的模型建立和统计分析
在 30 L 生物反应器中进行补料分批培养，同时分别改变搅拌速度和表层通气流速作为变量，采用中心复合设计确定它们对抗体滴度的单一影响和交互影响。表 2 总结了 13 组实验中抗体表达水平，范围为 950-1850 mg/L，表明确定最佳工艺条件的重要性。为了评估模型的准确性和可重复性，实验的中心点重复了 5 次实验（130 RPM 和 110 LPM）。
根据 CCD 结果，较低水平的表层通气流速和搅拌速度（实验编号6和7）导致培养 pH 值较低（分别为6.83±0.10和6.88±0.10），从而导致生产率降低（分别为950和1165 mg/l）（表2）。为了进一步确定表达的 IgG 水平与相应变量的相关性，它们的关系由以下方程建模。
Y=−11272+327.4 A+157.51 B−11.685 A×A −0.5232 B ×B−0.567A×B
Y 是 mAb滴度（mg/L），A 和 B 分别是表层通气流速（LPM）和搅拌速度（RPM）。通过 F 检验和响应曲面的二阶模型的方差分析评估方程的显著性水平（表4）。根据结果，搅拌速度（B）和表层通气流速（A）的平方以及交互项（AB）具有统计学意义。通过计算的搅拌速度（1438.94）和表层通气流速（270.05）的 F 值，并对所选参数进行方差分析表明该模型是显著的（p≤0.05）。此外，mAb 滴度的回归模型显示决定系数具有显著值（0.9975），预测的R2 （0.9887）与调整后的R2（0.9957）合理一致。此外，失拟值0.34表示模型相对于纯误差的有效性。
使用公式 3 创建的响应曲面和2D等值线图如图 2 所示。椭圆等值线图表示变量之间的显著交互作用。图 2 表示两个自变量的响应面图。可以看出，当表层通气流速保持在中间水平（10 LPM）时，获得了最大的 mAb 滴度。表层通气流速越高，培养基浓度增加，这是由于较高的蒸发导致培养基的渗透压高于500 mOsm/kg。在渗透压升高时，细胞活率降低。这可能是在非常高的表层通气流速（15 LPM）下 mAb 滴度降低的原因。然而，较低的流速无法有效控制pH和去除CO2，同时也表明细胞培养操作存在最佳的顶部空间通气水平。此外，通过将搅拌速度从110 RPM 提高到150 RPM，可以提高 mAb 滴度（图 2）。根据抗体滴度的预估，对以低搅拌速度生长的培养和高搅拌速度的培养中的乳酸、pCO2 和 pH 值的比较分析显示，随着 CO2积累的变化，pH 值曲线不同，但残留乳酸浓度没有变化（图 3）。因此，较高的搅拌速度似乎有利于CO2去除和 pH 控制。这些结果与 Shetty 的发现形成鲜明对比，Shetty 报告了不同搅动速率对 NS0 细胞生长和生产力的影响最小。
中心复合实验设计显示，在大规模细胞培养中，通过表层通气流速和搅拌速度的相互作用效应可以有效控制 pCO2水平升高。因此，可以通过同时优化表层通气流速和搅拌速度来将 pH 值控制在所需范围内。
二、模型验证
RSM 的点预测功能用于计算每个因子的最优值（图 4）。在最佳条件下进行了 3 次独立实验，验证搅拌速度为 145 RPM、表层通气流速为 10.5 LPM 的模型。预测值和实验值之间的强相关性证明了响应模型的适当性（p>0.05）。优化工艺条件后，最终蛋白质滴度提高了 51%。
三、放大研究
利用优化的参数，将细胞培养放大至250L生物反应器，同时采用恒定叶轮单位体积功率（P/V）作为放大标准。根据双方差的分析结果，30 L和250 L生物反应器之间的最大细胞密度、活率、mAb 滴度、pH 值、pCO2和乳酸特异性产生量没有显著差异，表明该方法的可靠性和稳定性（图 5）。这些结果证实，增加表层通气量和搅拌速度的交互效应可有效提高 250 L 中试规模的 mAb 产量。
一项关于单一因素（表层通气流速）对 mAb 滴度影响的初步研究表明，在大型生物反应器中，单一增加表层通气流速不足以去除二氧化碳。这一观察结果可能是由于大型生物反应器的表面积与体积比更低，导致气体滞留时间更长。因此，单独增加表面曝气流速（表层通气流速）并不被认为是二氧化碳去除的有效方法。然而，通过将搅拌速度和表层通气流速的最佳水平结合起来，可以将 pH 值有效地维持在 6.9-7.1 的范围内，从而克服了这一问题（图 5D）。
四、结论
pH 值是影响生产率的最重要参数之一，尤其是在工业生产过程中。这主要是因为只有在较窄的 pH 值范围内才能达到最高的比生长速率和最大的细胞比生产率。因此，本研究的目的是找到一种通过加速二氧化碳去除来控制 pH 值的有效方法。通过 CCD 对影响参数进行优化，可以很好地发现搅拌速度和表层通气流速对控制pH值和提高生产率的交互影响。尽管之前已有关于搅拌速度对二氧化碳去除效率影响的报道，但只有少数研究调查了表层通气流速对二氧化碳去除的影响。结果表明，这两个参数在同时控制培养pH值方面具有正向的交互作用，并且二氧化碳的去除率和 mAb 表达水平（约增加 51%）也显著增加。该策略可以考虑作为一个有效且易于应用的方法来控制生产工艺中的pH和细胞表达提高生产率。
来源：科学酷少