摘要：在健康与营养科学的前沿领域，烟酰胺单核苷酸（NMN）因其在缓解衰老和疾病方面的出色功效，备受各界关注。它作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）的关键前体，在细胞的能量代谢和氧化还原稳态维持中发挥着十分关键的作用。
在健康与营养科学的前沿领域，烟酰胺单核苷酸（NMN）因其在缓解衰老和疾病方面的出色功效，备受各界关注。它作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）的关键前体，在细胞的能量代谢和氧化还原稳态维持中发挥着十分关键的作用。
研究表明，补充 NMN 能够有效恢复人体中的 NAD⁺水平，进而激活去乙酰化酶等一系列依赖 NAD⁺的酶，对促进细胞长寿、修复受损的 DNA 以及增强细胞应对压力的能力至关重要。因此，NMN 也成为了一种极具潜力的营养补充剂。
近日，来自中国科学院微生物研究所和中科欣扬的研究人员，利用基因工程改造大肠杆菌来高效生产 NMN，最终通过全细胞催化实现了 15.66 g/L 的 NMN 滴度，并在 2 L 生物反应器中达到了 46.66 g/L，实现了迄今为止报道的最高产量，显示出 NMN 可持续工业生产的巨大潜力。这项研究题为“High-Level Production of Nicotinamide Mononucleotide by Engineered Escherichia Coli”，发表于 Journal of Agricultural and Food Chemistry 期刊。
图｜大肠杆菌中的 NMN 生物合成途径
首先，在众多的 NMN 合成途径中，研究人员选择了以烟酰胺（NAM）和磷酸核糖焦磷酸（PRPP）为前体，在烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）催化下合成 NMN 的经典路线。他们以大肠杆菌 BW25113 为基础，将具有高酶活性的 Chitinophaga pinensis 的 NAMPT（CpNampt）和 Bacillus subtilis 的 PRPP 合成酶（BsPRS）引入其中，构建了 pBAD-CpNampt-BsPrs 质粒，以期在大肠杆菌中实现 NMN 的高效合成。
但是，起初未检测到 NMN 产生，经分析可能是竞争途径抑制了其合成。研究人员在敲除 pncC、nadR、ushA、umpG、umph 和 pncA 等基因后，摇瓶发酵中 NMN 产量达到 160.66 mg/L。此时，研究人员发现细胞内仍有大量 NMN 囤积，这表明大肠杆菌自身的 NMN 转运蛋白效率低下，为了解决这个问题，他们引入了来自 Bacillus mycoides 的高效转运蛋白 PnuC，对菌株进行优化。改造后的菌株 NMN005-Cp 成功将细胞外 NMN 产量提升至 416.67 mg/L。
图｜筛选外源 NAMPT 酶以提高大肠杆菌中 NMN 产量
为了进一步提高 NMN 的产量，研究人员决定筛选出高活性 NAMPT 酶。研究人员从多种来源挑选 16 种 NAMPT 酶进行研究，通过分析酶与底物亲和力等指标，发现来自 Vibrio nigripulchritudo 的 VniNampt 对 PRPP 和 NAM 亲和力较高。实验表明，过量表达 VniNampt 时，其催化 NAM 转化为 NMN 的效率最高。实验结果也有力地证明了这一点，在大肠杆菌中过量表达 VniNampt 时，其催化 NAM 转化为 NMN 的效率远远高于其他酶，产量高达 823.07 mg/L。
不仅如此，研究人员认为，作为 NMN 合成的关键前体，PRPP 的充足供应也可以进一步提升 NMN 的产量，考虑到木糖可以通过比葡萄糖更短的途径代谢生成 PRPP，研究人员决定在大肠杆菌中强化木糖利用途径，实现葡萄糖和木糖的协同利用，为 PRPP 的生产提供更多能量。
研究人员敲除了 ptsG 基因解除碳代谢物阻遏（CCR）效应，同时过表达 glk 基因恢复葡萄糖非 PTS 途径利用，过表达木糖转运蛋白 XylE 和 XylFGH等，构建了工程菌株 NMN011。
图｜增强木糖利用以增加 NMN 产量
最终，在以木糖为唯一碳源的全细胞催化实验中，工程菌株 NMN011 表现出色，能在 24 小时内将 10 g/L 木糖完全消耗，产生 7.27 g/L NMN，这是木糖和 NAM 合成 NMN 的最高产量。而当使用葡萄糖和木糖混合碳源时，NMN011 菌株能同时高效利用两种糖，NMN 产量达 15.66 g/L，表明双糖协同利用能够更好的显著提高 NMN 产量。
为评估工程菌株 NMN011 的工业化生产潜力，研究人员还采用了分批补料策略进行高密度发酵，即持续以 0.4 - 0.6 g/L/h 速率补加 NAM，控制温度、pH 值和溶解氧等条件。当以葡萄糖为唯一碳源时，72 小时内 NMN 产量达 26.07 g/L；加入木糖与葡萄糖共同作为碳源时，NMN 产量进一步提升，加入 20 g/L 木糖时，NMN 产量高达 46.66 g/L，这是目前报道的最高产量。
该研究不但为 NMN 的大规模生产提供了可行的技术方案，有助于满足市场对 NMN 日益增长的需求，使更多人受益于 NMN 在缓解衰老和疾病方面的功效，而且也利用微生物合成其他高附加值化合物提供了新的思路和方法。
未来，研究人员将继续努力，进一步优化菌株性能，提高 NMN 产量和生产效率，降低生产成本，提高生产过程的可持续性。例如，通过蛋白质工程技术对关键酶进行优化，提高其活性和稳定性；探索更有效的碳源利用策略，减少副产物生成；优化发酵工艺参数，实现更精准的过程控制等。
参考文献：
1、https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39658968/
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来源：生辉SciPhi