摘要：难以通过血脑屏障限制了蛋白大分子在体内的应用。在一项新的研究中，多所大学的研究人员报告了一种改造弓形虫的方法，能够通过血脑屏障，实现治疗性蛋白向中枢神经系统的递送。该研究为将帮助人们开发出蛋白质递送的替代方法。

难以通过血脑屏障限制了蛋白大分子在体内的应用。在一项新的研究中，多所大学的研究人员报告了一种改造弓形虫的方法，能够通过血脑屏障，实现治疗性蛋白向中枢神经系统的递送。该研究为将帮助人们开发出蛋白质递送的替代方法。

文章介绍

题目：工程化弓形虫分泌系统用于细胞内递送多种大治疗蛋白到神经元

杂志：Nature microbiology

影响因子：20.5

发表时间：2024年8月

#1

研究背景

Background

蛋白质递送需要应对诸多艰巨挑战，它们的大分子尺寸以及通常亲水性和带电的性质使它们无法被动地穿过生物屏障。而血脑屏障会屏蔽几乎所有的蛋白质。各种纳米材料和蛋白质工程方法已经尝试解决这些挑战，但效率往往有限。刚地弓形虫是一种普遍存在的寄生虫，可主动迁移到中枢神经系统，通过与宿主共同进化而微调的复杂机制渗透到血脑屏障。弓形虫有三种分泌蛋白质的细胞器，其中棒状体和致密颗粒可以将效应蛋白直接递送到宿主细胞。因此，研究人员尝试利用这两种细胞器探究弓形虫改造后能否将大型治疗性蛋白递送至中枢神经系统，有助于开发向中枢神经系统递送治疗性蛋白的新方法。

#2

研究思路

Methods

该研究确定了弓形虫作为一种潜在的生物工具，可以建设性地将感兴趣的蛋白质递送到中枢神经系统。研究人员首先测试了不同大小、功能和细胞内靶点位置的蛋白，并观察到几种治疗性神经元蛋白的细胞内高水平递送。接下来，使用包括神经元和脑类器官在内的各种体外模型来描述影响递送的因素以及递送蛋白的活性。在小鼠中，展示了腹腔内给药后向大脑的递送并表征了其动力学。最后，使用报告系统来表征分泌棒状体和致密颗粒蛋白在大脑中的3D分布。该研究为工程化刚地弓形虫作为体外和体内细胞内蛋白质递送载体的应用提供了概念验证。

#3

研究结果

Results

1. 靶向棒状体的异源蛋白和工具

由于弓形虫能够在细胞内递送蛋白质，研究人员主要利用其棒状和致密颗粒分泌细胞器。研究人员设计了一种蛋白融合策略，选择toxofilin（TGME49_214080）作为棒状体靶向的载体，GRA16（TGME49_208830）作为致密颗粒靶向的载体。对一个子集进行了哺乳动物和弓形虫密码子使用情况的测试，后者被标记为“opt”。为了检测棒状体的分泌，研究人员在细胞内制备了与神经元蛋白天冬氨酸酰基化酶（ASPA、ASPAopt）、运动神经元存活蛋白1（SMN1）、半乳糖神经酰胺酶（GALC、GALCopt、GALC-TAT）、parkin E3泛素连接酶（PARK2）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、甲基化CpG结合蛋白2（MECP2、MECP2opt）和转录因子EB（TFEBopt）融合的toxofilin。发现表达受toxofilin预测的内源性启动子控制。此外，研究发现有3个融合基因，即GDNF、PARK2和TFEB，成功定位于棒状体分泌细胞器。接下来，研究人员测试了具有广泛治疗潜力的工程锌指核酸酶（ZFN）和Cas9的递送，发现检测的ZFN异源二聚体和Cas9-gRNA共递送的5个变异中，所有变异均成功表达并靶向到棒体。然而，它们的活性在报告细胞中无法检测到，这可以解释为分泌水平低、核酸酶活性低或报告基因诱导的时间不足（图1）。总体而言，弓形虫融合蛋白GDNF、Parkin、TFEB、ZFNs和Cas9在寄生虫棒状体的正确定位为弓形虫作为载体进行瞬时非侵入性递送提供了有希望的一步，但还需要进一步研究来提高融合蛋白在宿主细胞中的分泌水平和/或活性。

图1 通过与弓形虫蛋白融合将治疗蛋白靶向到棒状分泌细胞器

2. 通过致密颗粒的蛋白质细胞内递送

为了将治疗蛋白靶向到致密颗粒，研究人员建立了基于内源性致密颗粒蛋白GRA16的融合策略。细胞内弓形虫通过致密颗粒分泌的蛋白不可避免地首先被递送到包裹着弓形虫的寄主液泡（PV），PV将细胞内弓形虫与宿主细胞质分离。为了到达宿主细胞的细胞质，这些蛋白必须通过PV膜（PVM）上的一个高选择性蛋白转运复合体输出。研究人员生成了与ASPA、ASPAopt、SMN1、GALC、GALCopt、GALC-TAT、MECP2、MECP2opt和TFEBopt融合的GRA16编码结构，并使用预测的GRA16内源性启动子。GRA16融合的核蛋白SMN1，TFEB和MeCP2成功定位于PV和宿主细胞核。这表明这些蛋白成功靶向到致密颗粒，分泌到PV，输出到宿主细胞的细胞质，并在其活性位点宿主细胞核中积累。由于MeCP2和TFEB显示出最稳健的递送和靶向性，研究人员将重点放在它们上以进行进一步的表征（图2）。

图2 利用与GRA16的融合，靶向治疗性蛋白通过弓形虫致密颗粒在细胞内传递

3. 双重蛋白分泌，致密颗粒蛋白传递和蛋白质传递到神经元的动力学

为了验证弓形虫分泌途径是否可以通过同一载体多重递送多个蛋白，研究人员设计了一条从棒状体和致密颗粒同时递送的线路。该细胞系被设计表达与Cre重组酶融合的toxofilin和GRA16-MeCP2（称为MeCP2: TCre）。为了证明其可作为研究体外疾病模型的工具，研究人员使用了Cre介导突触囊泡蛋白tdtomato激活的小鼠的皮质和海马神经元原代培养物。在接种后48小时，研究人员观察到GRA16-MeCP2和Synaptophysin-Tdtomato punctae的宿主细胞核聚集，表明工程化的弓形虫可以同时递送来自两个独立分泌系统的蛋白（图3）。

此外，研究人员开发了个定制的高内涵成像管道，用来分析感染和蛋白质递送的动力学。结果显示，在感染复数（MOI）= 3的给药后24小时，平均50-62%的人皮肤成纤维细胞（HFF）被弓形虫感染，其中73-86%接受了递送的蛋白。单独表达GRA16的弓形虫，GRA16-MeCP2或GRA16-TFEB在侵袭，增殖和递送蛋白到宿主细胞核的能力上是相似的。融合蛋白的细胞核水平比单独的GRA16低8倍，表明尽管接受蛋白的细胞比例相似，但递送的蛋白量较低（图3）。这些结果提供了细胞感染动力学和蛋白递送的定量表征，并验证了一种新的可用于弓形虫蛋白递送自动化高内涵成像和分析的通用管道。

为了检测弓形虫在神经元中的传递，研究人员对接种了GRA16-HA、GRA16-MeCP2和GRA16-TFEB弓形虫的神经元进行免疫荧光，证实它们都能有效地感染并将蛋白递送到神经元。然后，研究人员使用MECP2敲除的LUHMES神经元来量化MECP2的递送水平，发现接种后24小时，其水平达到WT MECP2水平的58%（图3）。

图3 双重蛋白分泌，致密颗粒蛋白传递和蛋白质传递到神经元的动力学

4. 弓形虫传递MeCP2的功能检测

利用小鼠原代神经元，研究人员证明GRA16-MeCP2与异染色质DNA共定位于感染神经元，在处理小鼠神经母细胞瘤细胞后观察到相同的结果。为了进一步证明弓形虫传递的MeCP2的功能，研究人员使用pull-down实验检测了其与甲基化DNA的结合，弓形虫递送的GRA16-MeCP2显示了与内源性人MeCP2相似的甲基化DNA特异性结合。为了进一步研究递送的MeCP2的功能，研究人员分析了蛋白质递送在人脑皮质类器官中的转录效应。单细胞测序结果分析表明，与GRA16-HA相比，GRA16-MeCP2感染的神经元中“由MECP2转录调控的反应组”通路的调节存在差异。在对特定MeCP2靶点进行集中分析后，研究人员观察到CREB1的适度上调与MEF2C的下调（图4）。综上所述，这些发现为工程弓形虫递送功能性MeCP2提供了初步支持。

图4 通过异染色质结合、下拉实验和单细胞测序检测弓形虫传递MeCP2的功能

5. 小鼠全身给药后的脑递送

在证明弓形虫可以在培养的哺乳动物细胞系、神经元和脑类器官中递送MeCP2后，研究人员接下来寻求研究体内的蛋白质递送。研究人员基于ⅱ型Pru菌株构建了新的菌株，该菌株体内毒力较低，可以在小鼠中建立无症状潜伏感染。将这些细胞系腹腔接种小鼠，于注射后18天收集脑组织。尽管注射了GRA16-HA弓形虫的小鼠的囊肿数量略低于其他小鼠，但无论使用的是哪种弓形虫系，所有小鼠的大脑缓殖子囊肿水平均较高。共聚焦成像显示，注射GRA16-HA或GRA16-MeCP2弓形虫的小鼠的神经元细胞核中有HA染色。GRA16-MeCP2弓形虫的点状定位在神经元中富集，并且与小鼠内源性MeCP2和体外GRA16-MeCP2的定位相似。总的来说，这些发现表明弓形虫可以将MeCP2传递到小鼠的大脑神经元中。

接下来，研究人员比较注射后1个月和3个月小鼠脑组织和外周组织（肝、肺和脾）的弓形虫总水平，以检测MeCP2的异种表达是否影响弓形虫感染动力学或体内分布。发现弓形虫主要在大脑中检出，在周边检出少量弓形虫。无论弓形虫系如何，在感染和生理盐水注射的小鼠中，脑炎症包括高水平的单核细胞和T细胞浸润。GRA16-HA感染小鼠在3个月炎症细胞计数较低，这与在感染急性期观察到的脑内弓形虫水平较低和体重没有显著下降相一致，这表明它们的感染较为有限，但在到达大脑之前已被清除（图5）。

图5 弓形虫在小鼠腹腔内给药后将MeCP2传递到中枢神经系统

6. 全清除脑内的3D体内递送分布

为了更详细地表征网状和致密颗粒介导的蛋白质递送在大脑中的分布，基于先前发表的含有弓形虫蛋白-Cre和GRA16-Cre的细胞系，研究人员利用Cre-lox系统在体内荧光标记接受网状和致密颗粒蛋白的细胞。结果显示，与GRA16-Cre相比，toxofilin-Cre被递送到更大的神经元中，这需要建立细胞内PV作为分泌的先决条件。研究人员还观察到每组弓形虫蛋白递送的总细胞体积的高度可变性。对于棒状体和致密颗粒分泌的蛋白质，在皮质中观察到最高水平的蛋白质递送，其次是海马，脑干，下丘脑和丘脑（图6）。

图6 小鼠腹腔内给药后，弓形虫在清除脑内的棒状体和致密颗粒介导的蛋白质递送的3D分布

小结

该研究表明，弓形虫可以用来解决许多与蛋白质递送相关的挑战，用于研究和治疗应用。该研究为使用翻译融合体在体外和体内驱动弓形虫的功能性蛋白质递送提供了强有力的支持。

参考文献

Bracha S, Johnson HJ, Pranckevicius NA, Catto F, Economides AE, Litvinov S, Hassi K, Rigoli MT, Cheroni C, Bonfanti M et al: Engineering Toxoplasma gondii secretion systems for intracellular delivery of multiple large therapeutic proteins to neurons. Nature microbiology 2024, 9(8):2051-2072. Doi: 10.1038/s41564-024-01750-6.

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来源：培养盒守护者