摘要：错配修复缺陷（dMMR）指四种错配修复（MMR）蛋白中至少一种表达缺失，主要由三种原因导致：MMR基因胚系突变、体系突变，以及MLH1基因启动子区高度甲基化。林奇综合征（Lynch syndrome，LS）又称遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC），是一种常染
前言
错配修复缺陷（dMMR）指四种错配修复（MMR）蛋白中至少一种表达缺失，主要由三种原因导致：MMR基因胚系突变、体系突变，以及MLH1基因启动子区高度甲基化。林奇综合征（Lynch syndrome，LS）又称遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC），是一种常染色体显性遗传病，通常由MMR基因胚系突变引起。与MMR基因突变相比，MLH1甲基化导致的MLH1蛋白缺失更为常见。多个指南共同推荐，在结直肠癌（CRC）和子宫内膜癌（EC）中，异常的MLH1免疫组织化学（IHC）结果应进行MMR基因胚系检测或肿瘤组织MLH1甲基化检测，甲基化提示散发性肿瘤[1-3]。
组成性表观突变
上述筛查流程采用MLH1基因甲基化检测，将散发病例排除在MMR基因胚系检测之外。虽然可以降低筛查成本，提高患者的依从性，但是忽略了组成性MLH1基因表观突变/甲基化（constitutional MLH1 epimutation/ methylation，也有翻译成结构性/体质性MLH1表突变）这样的罕见病例。组成性表观突变的特征是正常组织中单个等位基因的启动子甲基化和转录失活，外周血淋巴细胞（PBL，中胚层）、正常结肠粘膜（内胚层）、肌肉（中胚层）、口腔粘膜（外胚层）样本中均可能检测到[4]。组成性表观突变分为原发性和继发性，原发性表观突变没有明显的连锁序列变化，在减数分裂过程中是可逆的，偶尔以非孟德尔模式传递给下一代，很少与明确的癌症家族史相关；继发性表观突变由DNA序列改变的顺式作用引起，遵循孟德尔遗传模式传递[4-7]。组成性表观突变可能是嵌合性的，甲基化水平在不同等位基因和组织中具有异质性[4-5]。
MLH1和MSH2基因的组成性表观突变已被确定为LS的罕见病因。MSH2表观突变是典型的继发性表观突变，是位于MSH2上游17 kb的EPCAM基因3’端胚系缺失的结果[6]。组成性MLH1表观突变的分子机制较为复杂，发生在2-3%的突变阴性的疑似林奇家系中[7]。组成性甲基化病例表现为与MLH1-LS一致的早发性和/或多发性原发肿瘤；也会导致肿瘤出现MLH1缺失、MSI-H和MLH1甲基化，这些特征与常见的散发病例重叠[8]。
MLH1表观突变队列研究[8]
美国俄亥俄州的一项回顾性研究纳入了Columbus（n=1566）和OCCPI（n=3310）两个CRC队列，入组标准为（1）MLH1缺失和/或MSI-H，（2）MLH1甲基化，（3）PBL DNA或全血DNA的可用性。使用焦磷酸测序和甲基化特异性多重荧光PCR（MS-qPCR）两种检测方法分析血液DNA样本，任一检测产生的信号高于检测限，既认为样本甲基化阳性。
在Columbus队列中，95例甲基化检测成功，焦磷酸测序与MS-qPCR结果完全一致。有4例（4.2%）检测到组成性MLH1甲基化，诊断时年龄分别为34、36、52和74岁，患者均首发CRC，只有一例（Columbus-65）有家族史记录。患者Columbus-6大约一半的等位基因甲基化，其他3名患者的甲基化水平较低，提示嵌合性甲基化。
在OCCPI队列中，281例甲基化检测成功，焦磷酸测序与MS-qPCR结果完全一致。有4例（1.4%）检测到组成性MLH1甲基化，年龄分别为20、34、50和55岁，患者均首发CRC，均有不明确的家族史。3例患者约一半的等位基因甲基化，OCCPI-1血液中具有低水平（4.2%）嵌合甲基化，启动子区c.-93G＞A杂合。取其肿瘤和配对正常结直肠粘膜（NCM）检测，NCM检测到类似的低水平（2.6%）嵌合MLH1甲基化，在肿瘤中检测到高水平（60.8%）甲基化。MLH1启动子测序显示肿瘤中c.-93G＞A处未甲基化“A”等位基因的杂合性丢失（LOH），作为肿瘤发生的“二次打击”。
年龄分层显示年轻患者的组成性MLH1甲基化率高。在Columbus和OCCPI队列中，以年龄≤55岁为界，组成性甲基化率分别为75%（3/4）和23.5%（4/17），可以检测到大多数病例。虽然数据不全，但是4例具有BRAF V600E肿瘤检测结果的组成性甲基化患者均为BRAF野生型。与之前的报道一致，组成性甲基化患者BRAF野生型的频率更高。如果使用BRAF V600E检测代替MLH1甲基化作为MLH1缺失患者的筛查，组成性MLH1甲基化患者会进一步接受MMR基因胚系检测，并可能产生阴性/无临床意义的检测结果。
代表性研究
除了上述NCCN指南引用的队列研究以外，之前亦有一些关于组成性MLH1表观突变的研究或案例报道，包括原发性和继发性表观突变。我们从中挑选几个代表性研究。
研究一[6]：
法国的一项研究结合大片段PCR和高通量测序（NGS）的方法，研究了4个具有遗传性表观突变的家系和10例没有证实表观突变的患者。家系1检出MLH1 1号外显子3‘末端上游6 bp处AluYc序列的插入，长度为345个核苷酸。这种插入会导致MLH1基因的破坏，提供一个新的剪接供体位点，产生的转录本编码截短蛋白。带有Alu插入的等位基因在家系中与甲基化共分离。
家系2的先证者为CRC，一级亲属没有癌症病史，表现出MSI-H和PMS2孤立的蛋白表达缺失，但PMS2基因测序未发现突变。在患者肿瘤和PBL DNA中检测到MLH1启动子甲基化，并在6名无症状亲属中鉴定出表观突变。使用多重连接探扩增（MLPA）和比较基因组杂交阵列（CGH-array）发现包含EPM2AIP1 基因和 MLH1 1-6号外显子的大片段重复，重复片段大小约29.54 kb，片段两端位于Alu元件中，与甲基化共分离。
家系2显示组成性MLH1表观突变的常染色体显性遗传，以及包含 EPM2AIP1 和 MLH1 1-6号外显子的重复
在家系3中检出MLH1 1号内含子上的新发突变c.116+106G＞A，该突变在家系中与甲基化共分离。在10例没有证实表观突变的患者中，有一例（P4）也是该突变的携带者，但其患病和未患病的家属均未检出表观突变或c.116+106G＞A突变。家系4检出MLH1 c.27G＞A同义突变，该突变在之前的结肠癌家庭登记（C-CFR）多中心研究中已有报道[5]。在一例未证实患者（P5）中也检出该突变，但单倍型与家系4不同。此外，研究还在一例未证实患者（P3）中检出MLH1 5’UTR区的c.-167delA突变，与甲基化相关。
研究也证实了基因沉默先于DNA甲基化，表达程度较低的等位基因更容易甲基化的理论。有些突变本身导致等位基因完全失活，与表观遗传沉默无关，启动子甲基化可能作为失活的冗余机制出现。甲基化可以作为转录沉默的稳定机制，阻止细胞转录无功能的等位基因。此外，一些已经验证了对剪接功能有影响的突变没有相关的启动子高度甲基化，这可能与序列改变影响与表观遗传修饰元件的结合有关。
研究二[9]：
意大利的一项研究采用NGS和MS-MLPA等技术研究了56例患者的61个MLH1缺失肿瘤（CRC的BRAF均为野生型），有4个肿瘤样本的甲基化水平非常高（大于0.9），4例患者的血液DNA均鉴定出组成性MLH1甲基化。
在家系F-5中，两位成员P-09和P-10均携带MLH1 c.-168_c.116+713del胚系缺失，其罹患的三种肿瘤（2个CRC和1个EC）具有相同的体细胞甲基化模式。两位患者均为组成性MLH1甲基化携带者，证明MLH1启动子区的大片段缺失会导致该基因的表观遗传沉默，并被定义为继发性表观突变。
在家系F-6中，P-38是一名年轻女性CRC患者，携带PMS2 P794S胚系临床意义未明（VUS）突变，组织中检测到高水平的MLH1甲基化，血液中亦检测到甲基化。研究者将这种情况定义为MLH1原发性表观突变。三年后，这位患者患上了MLH1缺陷的复杂子宫内膜增生。
指南推荐
NCCN遗传性/家族性高风险评估：结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌指南对于组成性MLH1表观突变的检测，做了如下推荐[1]：
患者的组成性MLH1表观突变是一个罕见的例外。对于早发性CRC（≤55岁）、无BRAF V600E突变、IHC中MLH1缺失、无胚系MLH1致病/疑似致病突变或任何年龄MLH1启动子高度甲基化的>1个肿瘤患者，考虑转诊到具有基因检测专业知识的机构进行MLH1甲基化检测。评估组成MLH1表观突变采用血液或其他正常组织样本检测MLH1启动子区甲基化状态。总结
组成性MLH1甲基化是疑似LS肿瘤不可忽视的机制之一，在MLH1缺失且未发现MMR序列突变的患者中有一定的发生频率，Columbus队列为4.2%，OCCPI队列为1.4%[8]，C-CFR研究为3.8%（16/416）[4]。但是就总体而言，组成性MLH1甲基化在未经选择的CRC中极为罕见，Columbus队列为0.26（4/1566），OCCPI队列为0.12%（4/3310）[8]，其并不影响各指南对于MLH1甲基化提示散发性肿瘤可能性较大的推荐。
对于MLH1蛋白表达缺失的CRC和EC，MLH1基因启动子甲基化检测有助于明确肿瘤的MMR、MSI状态，排除林奇综合征的风险。此外，MLH1甲基化亦可提示EC的预后，辅助治疗方案的选择[10-11]，并且对分子分型也具有补充提示的作用[12]。飞朔生物的MLH1基因甲基化检测试剂盒采用MS-qPCR技术, 转化后仅需一步操作，可检出甲基化频率低至1%的样本。飞朔致力于为肿瘤个体化精准医学检测提供最具创新性的产品和服务，并持续更新现有产品。
参考文献
[1] NCCN遗传性/家族性高风险评估：结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌2024 v3
[2] CSCO结直肠癌诊疗指南2024
[3] CSCO子宫内膜癌诊疗指南2024
[4] Cancer Med. 2018 Feb;7(2):433-444.
[5] Genet Med. 2013 Jan;15(1):25-35.
[6] Genet Med. 2018 Dec;20(12):1589-1599.
[7] Fam Cancer. 2016 Jul;15(3):385-93.
[8] J Natl Compr Canc Netw. 2023 Jul;21(7):743-752.e11.
[9] Genes (Basel). 2023 Nov 9;14(11):2060.
[10] J Gynecol Oncol. 2021 Nov;32(6):e79.
[11] Cancer. 2022 Mar 15;128(6):1206-1218.
[12] 中华妇产科杂志2023年10月第58卷第10期
来源：飞朔生物
