siRNA小干扰核糖核酸（small interfering RNA）指一类长约21-23nt的双链RNA分子，一般3’端有两个游离的碱基，5’端有磷酸基团的双链RNA，其主要功能是与对应的mRNA结合后促使mRNA发生降解，减少对应蛋白的表达，进而达到基因沉默的效果。使用siRNA进行基因沉默因实验操作方便，深受众多科研工作者青睐，也成为了分子生物学应用中最常用的基因下调工具。siRNA序列的获取，可以采用以下方法：（核对种属很关键！！！）摘要：siRNA小干扰核糖核酸（small interfering RNA）指一类长约21-23nt的双链RNA分子，一般3’端有两个游离的碱基，5’端有磷酸基团的双链RNA，其主要功能是与对应的mRNA结合后促使mRNA发生降解，减少对应蛋白的表达，进而达到基因沉
➢首选方法应该是“文献法“，从文献中获取siRNA序列，文献中已经做过验证了，自己做出来可能性更大➢去预设计的siRNA库查询一、siRNA引物设计基本原则1. siRNA靶向位置♦靶点通常选择目的基因的CDS（编码序列）区，因为这里的序列在生物体内相对稳定且易于预测。一般来说，从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好。♦使用NCBI的BLAST工具对设计的siRNA序列进行比对，确保其特异性。比对时，可以选择nucleotide to nucleotide模式，数据库选择Genomic+transcript databases。BLAST结果中，siRNA靶向其他基因的错配数越大，特异性越好。♦考虑选择多个靶标，并对每个靶标设计2~4条siRNA序列以增加沉默效率。2. siRNA序列的起始碱基与长度一般来说，siRNA序列长度在19～29 nt之间，序列过长（如超过30nt）可能导致与其他mRNA非特异性结合的概率增大。研究表明，27 nt或29 nt的siRNA与21 nt siRNA相比，27 nt siRNA对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下得到，（不过还是应该具体问题具体分析，在设计引物的时候，考虑多种因素，多设计几对）。3. siRNA 3′端突出碱基的选择一般情况下，3′端的2 个碱基使用突出的dTdT（deoxythymidine dinucleotide）取代，能够增强siRNA 双链复合体的稳定性，进而增加siRNA的敲低效率，通常情况下，公司合成序列时会自动增加dTdT结构。
4. GC含量
GC（鸟嘌呤和胞嘧啶）含量应控制在30%~55%之间，也有说法认为理想的GC含量范围是35%~52%或35%~55%，适当的GC含量有助于保持siRNA双链的稳定性，同时提高基因沉默效率。5. siRNA 序列应避免连续碱基和反向重复序列siRNA序列中连续2个及以上G/C够降低双链RNA内在稳定性，从而降低siRNA在细胞中的敲低效率；连续3个以上的A和U可能终止由RNA Polymerase III介导的转录作用。siRNA序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构，这种结构的存在可以降低siRNA沉默效率。6. siRNA双链的内在稳定性一般情况下，siRNA的稳定性直接影响其最终在细胞中的敲低效率。在siRNA的反义链5’端第一个碱基尽量可能是为A或U; siRNA正义链的5’端第一个碱基尽量为G或C。7.序列特异性♦应避免连续的单一碱基（如连续4个以上的A或T）和反向重复序列，这些序列可能降低双链RNA的内在稳定性。♦siRNA序列中不应出现与目标基因以外的其他基因高度相似的序列，以减少脱靶效应。♦目前没有研究报道siRNA的干扰效率与mRNA中具体位置的关系，因此，在设计siRNA时候应考虑多条siRNA，siRNA对应到靶基因的不同位置或在靠近3′端多设计一条，不同序列之间间隔应该在25-30bp之上。8. siRNA正义链的碱基偏爱性正义链的第一位和第十九位碱基为A;正义链的第十位碱基为U;正义链的第十三位碱基不为G;正义链的第十九位碱基不为G或C时，siRNA 序列具有较高的基因沉默效率9.其它注意事项siRNA的3’末端突出碱基通常选择UU，其基因抑制效率最高，但是3’端应避免GG结构，因为RNase会降解以G为末尾的RNA单链。二、siRNA引物设计步骤 siRNA 有很多在线设计网站，接下来以两个经典网站为例，给大家详细介绍如何设计siRNA引物？siDirect 设计网站：http://sidirect2.rnai.jpDSIR 设计网站：http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.htmlNCBI网址: http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/1.在NCBI官网上搜索选项选择【Nucleotide】-搜索框输入【基因+物种+mRNA】-点击搜索。
2、使用siDirect 网站设计siRNA引物
1.输入基因序列：打开网址：http://sidirect2.rnai.jp，进入网站后，输入NCBI 上的GenBank编号：AB082923.1，复制FASTA序列填入，可以直接点击design siRNA ，也可以先选择下方的options 进行参数设置。3、使用DSIR 设计网站设计siRNA引物
1.输入网址：http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html，进入网站后输入基因名称，复制基因序列填入框内或者选择保存的tex 文件夹上传该序列。接下来，设置相应的参数，选择siRNA引物的长度，避免产生免疫刺激基序这一栏选择：Yes, 网站会针对设计的引物进行评分，评分越高意味着沉默效果会更好。来源：金开瑞生物
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