摘要：脑类器官为大脑发育和疾病建模提供了前所未有的见解，并为药物筛选带来了希望。最近德国耶拿大学Jay Gopalakrishnan团队提出了一种可靠的生成大规模人脑类器官（Hi-Q脑类器官）的方法，能够在多个人工诱导多能干细胞（hiPSC）来源的细胞系中重复产生数
脑类器官为大脑发育和疾病建模提供了前所未有的见解，并为药物筛选带来了希望。最近德国耶拿大学Jay Gopalakrishnan团队提出了一种可靠的生成大规模人脑类器官（Hi-Q脑类器官）的方法，能够在多个人工诱导多能干细胞（hiPSC）来源的细胞系中重复产生数千个脑类器官。这些Hi-Q脑类器官具有可重复的细胞结构、多样的细胞组成和良好的功能性，且没有异常激活的细胞应激通路，支持冷冻保存和再培养。患者来源的Hi-Q脑类器官成功再现了小头症和早衰症的发育缺陷模型，并展现了与胶质瘤细胞系的可重复侵袭模式。Hi-Q脑类器官方法为个性化神经遗传疾病建模和药物发现提供了可靠的平台。
文章介绍
题目：大规模人脑类器官在小头症、胶质瘤侵袭模型及药物筛选中的可靠性
杂志：nature communications
影响因子：14.7
发表时间：2024年12月
#1
研究背景
Background
人脑类器官为支持神经遗传疾病的病理机制提供了研究平台，目前已经开发了几种方法来培养个性化定制的脑类器官。然而，人脑类器官生成的方法没有经过优化无法稳健地模拟不同的遗传性脑病。本研究开发了一种简化的培养方法，以诱导hiPSC直接分化为神经上皮，省略了胚状体阶段和细胞外基质的使用。通过使用定制设计的、无涂层的、预先图案化的微孔，可以完全控制早期神经球的大小。这种Hi-Q方法可以从多个hiPSC细胞系的中培养数百个脑类器官。此外，Hi-Q脑类器官表现出相似的细胞多样性、细胞结构、成熟时间和功能。重要的是，使用该平台生成的脑类器官显示出最少或没有异位激活的细胞应激通路，并且还可以成功冷冻保存和重新培养。Hi-Q脑类器官方法利用患者来源的脑类器官，可用于发育缺陷的建模、神经胶质瘤侵袭模型、抑制神经胶质瘤的侵袭药物筛选和个性化神经遗传疾病建模。Hi-Q脑类器官不仅为神经遗传疾病和肿瘤的研究提供了新的模型，还为药物筛选提供了一个高效的工具，具有广泛的应用前景。
#2
研究思路
Methods
采用6个独立的hiPSC细胞系生成Hi-Q脑类器官，以评估Hi-Q方法的整体多功能性。使用单细胞RNA测序剖析Hi-Q脑类器官的细胞多样性并将其与人脑相关联，组织学分析了Hi-Q脑类器官的细胞结构，Ca2+信号转导研究Hi-Q脑类器官神经网络中的自发和诱发活动，分析了解冻和重新培养后类器官细胞结构的完整性和组成。使用Hi-Q脑类器官模拟小头畸形、脑组织缺陷和神经胶质瘤侵袭等。
#3
研究结果
Results
1.Hi-Q脑类器官的生成
传统的脑类器官分化方法，通常包括将解离的hiPSC与细胞外基质一起嵌入，然后形成胚胎体（EB），再分化成神经球。传统方法中的神经球通常形态和大小不一，限制了每批次能生成的脑类器官数量，并且存在异质性，影响了生成的脑类器官的均匀性和细胞多样性。本研究认为若将解离的hiPSC直接引导分化成神经球，并在有限的空间内进行分化，可以限制异质性，生成均匀大小且数量较大的脑类器官，并提高均一性和细胞多样性。
将解离的hiPSC直接暴露于神经诱导培养基中，并将其置于带有圆底的微孔板中，以诱导神经球的形成。该微孔板由医疗级惰性环烯烃共聚物（COC）制成，具有理想的表面特性。微孔板包含24个大孔，微孔的开口处设计有185个大小相同的微孔，每个微孔的尺寸为1x1 mm，底部直径为180 µm，通常呈倒金字塔形状。这种几何设计促使细胞通过相互粘附的方式形成神经球。hiPSC在使用球形培养板时，即使不进行离心步骤，也能在一天内迅速沉降。为了验证Hi-Q方法的通用性，使用了6个独立的hiPSC细胞系（四个健康细胞系和两个来自小头畸形患者的细胞系）生成脑类器官。值得注意的是，除了小头畸形患者的类器官外，这些类器官随着时间推移逐渐增大。使用Hi-Q方法，在39个批次中共生成了约15,373个类器官。测量了300个随机选择的Hi-Q脑类器官，结果显示，类器官大小在同一批次内以及不同hiPSC细胞系之间高度一致。此外，类器官从第20天到第60天一致且成比例地增大，表明在Hi-Q方法下，类器官的生长不会异常波动。所有类器官在培养过程中都表现出高度完整性，在300个类器官中，只有一两个类器官出现解体。这些结果表明，Hi-Q方法具有稳健性、通用性，并且易于操作（图1）。
图1 Hi-Q脑类器官的生成
2.Hi-Q脑类器官具有相似的细胞多样性，且不受外源性应激通路的影响
为了剖析Hi-Q脑类器官的细胞多样性并与人脑进行比较，进行了单细胞RNA测序。首先进行了批次间相似性测试，对来自三个独立批次的25天Hi-Q脑类器官进行了测序和比较，使用2000个最具变异性的基因来评估批次之间的相似性。分析结果显示，细胞并未按批次聚类，表明不同批次之间的相似度很高，或者批次之间的变异性较低，因此不需要对批次间变异进行修正。为了简化批次间相似性的分析，选择三种主要的细胞类型：前体细胞（基于SOX2、GLI3和PAX6）、循环前体细胞（基于MKI67、CENPF和NUSAP1）以及早期神经元（基于DCX、NCAM和GAP43）。分析不同批次中这些细胞类型的比例差异时，未发现显著差异，表明Hi-Q脑类器官中各批次细胞类型和比例之间变异性较低。
为了剖析不同年龄阶段的细胞多样性变化，研究人员分析了来自三个脑类器官的16,228个细胞，这些细胞分别来自60、90和150天时的样本。分析结果显示，这些细胞属于不同类型。再次应用knn方法分析细胞转录变化的距离和进展，结果显示，三个时间阶段的脑类器官均包括结构性、未成熟、增殖中和神经元群体。
通过标注细胞类型，评估了Hi-Q脑类器官在不同阶段的相似性和成熟度。发现同一年龄段的个体脑类器官显示出相似的细胞比例，且随着类器官的逐步成熟，尤其是90天和150天的类器官中，成熟神经元类型（尤其是兴奋性神经元EN）逐渐积累。使用PCA分析同一年龄组内脑类器官的转录水平相似性。结果显示，不同类器官在同一年龄组内的细胞组成高度相似，而不同年龄组之间差异显著，证明Hi-Q方法能生成高度可重复的脑类器官。
有研究指出，激活细胞应激通路会干扰类器官的发育过程，影响人脑细胞类型的形成。通过检测Hi-Q脑类器官中的应激标志物PGK1、ARCN1和GORASP2的表达水平，结果表明Hi-Q脑类器官的应激标志物表达低于已发布的脑类器官数据集，但略高于成人大脑数据集。这一分析表明，Hi-Q脑类器官在体外培养中未完全模拟大脑发育的自然条件，但相对较少激活不正常的细胞应激通路，从而减少了细胞类型的指定错误。该研究的时序化单细胞RNA测序数据表明，Hi-Q方法能够生成较少受培养条件诱导的应激影响、并且细胞多样性更接近体内情况的可重复性脑类器官（图2）。
图2 Hi-Q脑类器官在成熟过程中的细胞类型多样性
3. Hi-Q脑类器官随着时间的推移逐渐发育并显示出成熟的神经元标志物
使用组织学分析了类器官的细胞结构。选择标记来识别不同细胞类型，例如前体细胞标记（Nestin和SOX2）、早期神经元标记（DCX）等，并对IMR90来源的脑类器官在第20天和第60天进行定量分析。第20天的脑类器官主要显示出前体细胞和早期神经元的标记，几乎没有明显的成熟神经元标记物。尽管MAP2和TUJ-1标记的神经元表达存在，但仅局限于细胞体，并未完全分化为轴突，表明这些脑类器官处于神经分化的早期阶段。第60天的脑类器官在尺寸上更为突出，并且表达了更多成熟神经元的标记，显示出明显的皮层板结构，且皮层厚度相似。随着时间的推移，皮层神经元和层特异性神经元的比例增加，Tau、PCP4、PSD95、Synapsin-1和CTIP2阳性细胞的数量在第60天的脑类器官中增多。为了验证Hi-Q方法培养的脑类器官是否能展示不同的皮层层次结构（如脑室区/亚脑室区（VZ/SVZ）和外部SVZ（oSVZ）），在单细胞RNA测序数据中测试并定量了相应的标记物，并对脑类器官切片进行了SVZ（TBR2）和oSVZ（PTPRZ1和磷酸化Vimentin）标记物的染色。这些数据表明，使用Hi-Q方法培养的脑类器官能够生成早期脑细胞类型，并分化为与早期脑胚性区分化的成熟细胞类型（图3）。
图3 Hi-Q脑类器官会随着时间的推移而成熟
4. Hi-Q脑类器官中的自发活动和神经元网络
接下来，进一步探讨Hi-Q脑类器官是否表现出功能性活动，并能形成活跃的神经网络。细胞内Ca²⁺信号是发展中和成熟大脑中神经活动和网络形成的可靠指标。为了探测功能性活动，在第30、40、50和150天对脑类器官进行细胞内Ca²⁺成像。通过注射用钙指示剂染料Oregon Green BAPTA1-AM（OGB-1）对脑类器官进行染色，基本染色了视野中的所有细胞体。通过OGB-1荧光实时成像，研究发现所有分析的样本阶段中均显示出生动的自发细胞内Ca²⁺信号。在各个年龄组中，约有一半的细胞（42-54%）表现出活跃的Ca²⁺信号。Ca²⁺信号的幅度和持续时间具有变化性。在每个阶段都检测到了持续10-20秒的单次短暂事件以及持续1-2分钟的爆发性事件。此外，还观察到了超慢的Ca²⁺波动，通常较快的事件会叠加在这些超慢波动上。在40、50和150天的脑类器官中，使用1µM的河豚毒素（TTX）显著抑制了自发的Ca²⁺活动。这表明Ca²⁺信号大多是由动作电位的生成和电压依赖性Ca²⁺通道的激活引起的。接下来，通过浴灌注10秒应用神经递质谷氨酸和GABA，进一步表征脑类器官的功能活动。所有测试的细胞都对1 mM谷氨酸或1 mM GABA的应用作出了强烈且持久的Ca²⁺瞬变反应。在50天的脑类器官中，谷氨酸引发的Ca²⁺信号被NMDA受体拮抗剂APV显著抑制，并且通过联合使用AMPA受体拮抗剂NBQX进一步抑制。上述结果表明Hi-Q脑类器官发展出了功能性活跃的神经网络，其中的细胞表达了电压门控的、对TTX敏感的Na+通道和电压依赖性的Ca²⁺通道，这是分化神经元的主要标志（图4）。
图4 Hi-Q 脑类器官神经网络中的自发和诱发活动
5. Hi-Q脑类器官可以冷冻保存、解冻和重新培养
本研究成功将18天龄的Hi-Q脑类器官冷冻并在液氮中保存。经过3个月的冷冻保存后，解冻并重新培养，观察器官的恢复情况。18天龄的脑类器官主要包含未分化的增殖SOX2阳性前体细胞，表现为TUJ-1阳性的原始皮层板。解冻后48小时，类器官形态略有变形，但12天后形态与从未冷冻的对照组相似，解冻和重新培养未导致显著的解离或大小变化。解冻后的类器官至少恢复了75%的活性，大多数情况下恢复率可达到90%。
48小时和10天后解冻的器官在死亡细胞频率和细胞结构上的差异，表明存活的细胞在冷冻保存后成功恢复。接下来，研究了冻存和复培养后的脑类器官的细胞结构完整性和组成。使用免疫染色技术标记SOX2（神经前体细胞NPC）、TUJ-1（原始皮层板）、TUNEL（凋亡细胞）。结果显示，复苏培养后的脑类器官的细胞结构与未冻存且未复苏培养的对照组非常相似。在冻存和复培养的脑类器官中，TUNEL阳性细胞的频率与对照组没有显著差异。到第60天，冻存复培养后的脑类器官展示了Synapsin-1阳性的成熟神经元，细胞结构与未冻存的对照组没有区别。与18天的脑类器官不同，35天或40天的脑类器官在冻存后复培养失败。
这些脑类器官在复培养后显示出严重的细胞结构损伤，并且TUNEL阳性细胞显著增加，表明它们在解冻后未能恢复。以上结果表明，使用Hi-Q平台生成的脑类器官在早期分化阶段能够成功冻存，并在解冻后复培养时表现出良好的活力和健康状态（图5）。
图5 Hi-Q 脑类器官的冷冻保存、解冻和再培养
6. 患者来源的Hi-Q脑类器官可以重现不同类型的遗传性脑部疾病
研究团队测试了它们在模拟不同类型神经遗传性疾病中的应用。使用Hi-Q脑类器官模拟原发性小头症（CDK5RAP2功能丧失）和早衰相关的Cockayne综合症（CSB），在使用相同数量的hiPSC（健康对照、CDK5RAP2突变、Cockayne综合症患者来源）生成Hi-Q脑类器官后，30天龄的CDK5RAP2患者来源脑类器官体积较小。相比之下，来自CSB患者的hiPSC生成的脑类器官体积较大，但在较晚时间点明显崩塌，表明在这两种模型中，导致神经上皮形成的细胞功能异常。对30天龄Hi-Q脑类器官进行免疫染色，标记SOX2阳性前体细胞和TUJ1阳性早期神经元。对照组脑类器官脑室区结构完好，相比之下，CDK5RAP2脑类器官脑室区结构受损，CSB脑类器官大脑结构受到了干扰。这些结果表明，Hi-Q脑类器官在模拟不同神经发育障碍方面具有良好的鲁棒性和应用潜力（图6）。
图6 Hi-Q脑类器官模拟小头畸形和脑组织缺陷
7. Hi-Q脑类器官模拟神经胶质瘤侵袭，适用于中等通量化合物筛选
胶质母细胞瘤（GBM）是一种侵袭性脑肿瘤，预后较差，含有胶质瘤干细胞（GSC），这些细胞可渗透到大脑并导致致命的疾病。目前，尚无有效的治疗方法，且GSC在大脑中的扩散性神经侵袭行为仍不可预测。通过利用Hi-Q脑类器官平台，精确测量GSC侵袭脑类器官组织的行为，并筛选出能够干扰GSC侵袭的化合物。Hi-Q脑类器官能够真实地再现GSC的侵袭行为。当5000个悬浮GSC或GSC球体被应用于50天培养的Hi-Q脑类器官时，GSC会在24小时内附着到周围的脑类器官上。在24到72小时内，GSC开始渗透进脑类器官，展示出典型的体内胶质瘤侵袭特征，如突出并延伸微管。基于这一实验设置，开始筛选能够阻止GSC神经侵袭特性的化合物。整合了180种具有已知生物靶标的化合物，用于设计中通量筛选实验。初步筛选确定了16种能够显著抑制GSC侵袭的化合物。作为二次筛选，选择了其中10种抑制效果最强的化合物，在1 μM浓度下进行验证。通过比较24小时和72小时侵袭实验中的GSC聚焦数量，确定了Selumetinib和Fulvestrant作为有效的GSC侵袭抑制剂。测试了这两种化合物在Hi-Q脑类器官中抑制GSC侵袭的效果，分别将单个细胞或球体形式的GSC应用于脑类器官中。采用高分辨率3D成像定量评估这些化合物对GSC侵袭的干扰效果。相较于对照组，这两种化合物显著抑制了GSC的侵袭能力，无论是单细胞还是球体形式的GSC。该筛选实验展示了Selumetinib和Fulvestrant在阻止GSC侵袭方面的潜力，可能为未来针对GBM的新疗法提供线索（图7）。
图7 Hi-Q脑类器官支持胶质瘤侵袭实验，并可适用于中通量药物筛选以识别抗胶质瘤化合物
总结
本研究开发了一种简化的培养Hi-Q脑类器官方法，还可以成功冷冻保存和重新培养。Hi-Q脑类器官方法利用患者来源的脑类器官，可用于发育缺陷的建模、神经胶质瘤侵袭模型。本实验成功地将Hi-Q脑类器官用于药物筛选，并确定了两种化合物有效扰乱了患者来源的GSC的侵袭行为。总而言之，Hi-Q脑类器官方法为个性化神经遗传疾病建模和药物发现提供了可靠的平台。
参考文献
Ramani A, Pasquini G, Gerkau NJ, Jadhav V, Vinchure OS, Altinisik N, Windoffer H, Muller S, Rothenaigner I, Lin S, Mariappan A, Rathinam D, Mirsaidi A, Goureau O, Ricci-Vitiani L, D'Alessandris QG, Wollnik B, Muotri A, Freifeld L, Jurisch-Yaksi N, Pallini R, Rose CR, Busskamp V, Gabriel E, Hadian K, Gopalakrishnan J. Reliability of high-quantity human brain organoids for modeling microcephaly, glioma invasion and drug screening. Nat Commun. 2024 Dec 19;15(1):10703. doi: 10.1038/s41467-024-55226-6.
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来源：培养盒守护者