摘要：来自拉霍亚免疫学研究所信号转导和基因表达部的Romain O Georges, Hugo Sepulveda, J Carlos Angel等多名研究人员发表了题为《Acute deletion of TET enzymes results in aneupl

来自拉霍亚免疫学研究所信号转导和基因表达部的Romain O Georges, Hugo Sepulveda, J Carlos Angel等多名研究人员发表了题为《Acute deletion of TET enzymes results in aneuploidy in mouse embryonic stem cells through decreased expression of Khdc3》的研究成果。

在该文章中，研究人员使用了CHIR-99021·HCl（AbMole，M1989）。

急性缺失TET酶会导致小鼠胚胎干细胞（mESC）出现染色体错分离和非整倍体，这与 Khdc3 基因表达下调有关。通过转录组分析，确定了 Khdc3 等三个基因在 TET 缺失的 mESC 中表达下调，且 Khdc3 基因附近的 DNA 甲基化增加。恢复 KHDC3 水平可防止非整倍体的发生。这些结果表明，TET 蛋白通过维持 KHDC3 的正常表达来防止 mESC 中的有丝分裂异常和维持染色体稳定性。

TET 酶家族的三个成员（TET1、TET2 和 TET3）通过改变基因组中 DNA 胞嘧啶的修饰状态来影响许多生物学过程。在人类和小鼠模型中，TET 功能丧失与 DNA 损伤、基因组不稳定性和肿瘤发生有关。然而，大多数关于 TET 缺陷细胞中基因组不稳定性的研究是在体细胞或在培养中维持了不同时间的干细胞模型上进行的，这可能会掩盖 TET 酶直接调节的途径。因此，本研究旨在探讨急性、严重的 TET 功能丧失对 mESC 染色体分离和稳定性的影响。

图 1：三重 TET 缺陷胚胎和 mESC 中非整倍体和染色体分离缺陷的出现。

条件性删除 TET 酶的小鼠胚胎干细胞系的生成：通过建立可诱导删除所有三个 Tet 基因的小鼠胚胎干细胞系，发现 4 - 羟他莫昔芬（4 - OHT）处理可诱导 Cre - ERT2 融合蛋白进入细胞核，驱动 loxP 位点重组，从而删除 Tet 基因。RNA - Seq 和 qRT - PCR 结果证实了 Tet 基因的删除，Western blot 和流式细胞术结果表明 TET1 和 TET2 蛋白表达消失，5 - 羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平迅速降低。

染色体错分离现象的观察：通过实时活细胞成像观察到，在 4 - OHT 处理后 4 天，Tet iTKO mESC 中染色体错分离（滞后染色体、微核）的发生率是 Ctrl mESC 的两倍，这表明 TET 酶在保护 mESC 中染色体准确分离方面起着直接或间接的作用。

非整倍体的检测：通过对单个细胞进行全基因组测序和中期染色体铺展分析，发现与 Ctrl mESC 相比，Tet iTKO mESC 中非整倍体核型增加了 2 - 3 倍，这表明在 Tet iTKO mESC 中观察到的染色体错分离导致了单个 TET 缺陷细胞中快速出现非整倍体核型。

体内胚胎实验：对早期（8 - 细胞阶段）胚胎进行免疫荧光染色，发现所有 3 种 TET 酶缺失的胚胎细胞核形态和大小明显异质，卵裂球数量、微核和卵裂球碎裂情况可变，这表明染色体错分离可能导致非整倍体。

转录组分析：通过对 Tet iTKO mESC 进行转录组分析，发现与 Ctrl mESC 相比，Tet iTKO mESC 中一些与有丝分裂、染色体分离、纺锤体组装、复制和 / 或 DNA 修复相关的基因表达下调，其中 Khdc3 下调最为显著。

基因表达的时间进程分析：Khdc3 和 Khdc2 mRNA 在 Tet iTKO mESC 中于 4 - OHT 添加后 6.5 天下调，时间进程分析表明，Khdc3 mRNA 在第 3.5 天开始明显下降，而 Khdc2 mRNA 在第 5.5 天开始下降不太明显。与之前发表的研究结果比较，发现只有 Khdc3 在分析的 Tet TKO mESC 中始终下调。此外，在长期缺失 Tet 的克隆群体中，Khdc3 表达仍然下调，而 Khdc2 表达恢复正常。这些数据表明，Tet 缺失对染色体分离的不利影响可能是由于 DNA 甲基化增加与 Khdc3 表达持续下调相关。

图 2：急性 Tet1/2/3 耗竭诱导许多基因表达改变，包括编码 SCMC 亚基 KHDC2 和 KHDC3 的 mRNA 下调。

DNA 甲基化分析：通过分析已发表的 ChIP - seq、WGBS 和 RNA - seq 数据，发现 DNMTs（特别是 DNMT3a）富集在 Khdc3 转录起始位点（TSS）的远端区域，而 TET1 和 TET2 占据更接近 Khdc2 和 Khdc3 TSS 以及基因体的区域，Tet TKO mESC 中 Khdc3 和 Khdc2 基因及周边区域的 DNA 甲基化增加，Khdc3 表达降低，而 Dnmt TKO 中 Khdc3 表达增加。

特定 DNMT 的作用：进一步研究发现，DNMT3a 是控制 Khdc3 位点 DNA 甲基化的最重要的 DNMT，并且 TET 和 DNMT 蛋白之间存在有趣的相互作用，即双缺失 Dnmt3a 和 Dnmt3b 可防止 Tet TKO mESC 中 Khdc3 启动子的 DNA 高甲基化，并且 Khdc3 表达恢复到超过 WT 水平。

Khdc3 在 Tet iTKO mESC 中的重新表达逆转了非整倍体表型

基因编辑和表达实验：通过 CRISPR / Cas9 系统编辑 Khdc2 和 Khdc3 基因，发现 Khdc2 或 Khdc3 缺失会导致 mESC 中非整倍体增加。在 Tet iTKO 和 Ctrl mESC 中诱导表达 Khdc2 或 Khdc3，发现 Khdc3 表达可使 Tet iTKO mESC 中非整倍体的频率从约 60％降至约 20％，类似于 Ctrl mESC 中的基础频率，而 Khdc2 表达则不能逆转 Tet iTKO mESC 中的非整倍体高频率。这些数据表明，TET 酶至少部分通过确保 mESC 中正常的 Khdc3 表达来控制有丝分裂期间正常的染色体分离。

本研究表明，TET 蛋白对确保 mESC 中染色体分离的保真度很重要，这一作用是通过下调 Khdc3 来介导的。急性 Cre 介导的 Tet1、Tet2 和 Tet3 基因缺失导致 mESC 中出现明显的有丝分裂异常、染色体错分离和非整倍体，这一表型至少部分是由于 Khdc3（Filia，Ecat1）的下调所致，Khdc3 编码一种含 KH 结构域的蛋白质，最初被鉴定为母源效应基因产物 NLRP5（MATER）的相互作用伙伴，是皮层下母体复合物（SCMC）的核心成分。Khdc3 在 Tet Tfl mESC 中的表达可防止 Tet iTKO mESC 在 4 - OHT 暴露后快速出现非整倍体，而 Khdc2 的表达则没有这种作用。

此外，研究还讨论了 Khdc2 和 Khdc3 在维持 mESC 基因组稳定性中的作用。虽然 Khdc2 和 Khdc3 mRNA 在 Tet iTKO mESC 中均迅速下调，但 Khdc3 表达在长期培养后仍下调，而 Khdc2 表达恢复。这表明 Khdc3 可能独立于 Khdc2 来防止 Tet iTKO mESC 中的染色体不稳定；或者，因为 Khdc2 mRNA 在对照 mESC 中表达水平高于 Khdc3 mRNA，并且在急性缺失或长期培养的 Tet iTKO mESC 中下调不明显，所以这两种蛋白质可能作为一个复合物发挥作用，其中 KHDC3 蛋白是限制性的，而 KHDC2 蛋白不是。

最后，研究指出 DNA 甲基化减少导致的 DNMT 缺乏会诱导非整倍体，目前正在研究除了 Khdc3 下调之外，异染色质中 DNA 甲基化减少是否也会导致三重 TET 缺陷 mESC 中观察到的非整倍体增加。

综上所述，本研究揭示了 TET 酶在维持 mESC 染色体稳定性和基因组稳定性中的重要作用，为进一步理解 TET 相关疾病的发生机制提供了重要的理论基础。

来源：AbMole