摘要：2023年12月，美国学者在期刊Science Translational Medicine（IF:17.1）发表了一篇题为“Inhibition of RIP1 improves immune reconstitution and reduces GVHD

文章介绍

2023年12月，美国学者在期刊Science Translational Medicine（IF:17.1）发表了一篇题为“Inhibition of RIP1 improves immune reconstitution and reduces GVHD mortality while preserving graft-versus-leukemia effects”的文章。

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摘要

Abstract

移植物抗宿主病（GVHD）是造血细胞移植（HCT）后无复发死亡（NRM）的主要原因。炎症细胞因子对关键的GVHD靶点，如肠道干细胞（ISC）造成损伤，并激活受体相互作用蛋白激酶1（RIP1），这是凋亡和坏死的关键调节因子。本文研究了RIP1在急性GVHD中的作用，使用HCT患者的样本，在体外用人和鼠的胃肠道类器官模拟GVHD损伤，在体内用几种已充分描述的鼠HCT模型来阻断RIP1的激活。增加的磷酸化RIP1在急性GVHD患者胃肠道活检中的表达与组织损伤和预测的NRM相关。无论是RIP1的基因失活还是RIP1抑制剂GNE684都能防止ISC在体内和体外GVHD诱导的凋亡。连续14天给予GNE684能减少小鼠三个GVHD靶器官（肠道、肝脏和脾脏）中的炎性浸润。令人意外的是，GNE684给药还能逆转GVHD期间肠道和肝脏中调节性T细胞的显著损失，减少脾脏T细胞的耗竭，从而改善免疫重建。无论是通过药物还是遗传学方法抑制RIP1都能提高长期生存率，且不影响淋巴细胞和髓系白血病小鼠模型的移植物抗白血病（GVL）效应。因此，RIP1抑制可能成为非免疫抑制性的GVHD治疗方法。

#2

研究思路

Methods

此项研究主要关注抑制RIP1在造血细胞移植后的潜力，以改善免疫重建、降低GVHD的死亡率，并保留移植物抗白血病效应。该研究采用了综合方法，包括体外和体内实验，以及临床数据分析。他们使用ImageJ软件对全长和加工后的caspase-3水平进行定量。通过免疫组织化学方法评估肠道活检中的磷酸化RIP1（pRIP1）表达。还使用Prism和R统计软件包进行统计分析。研究还描述了从小鼠肠道组织中建立和传代类器官的过程，这为研究RIP1抑制对肠道干细胞的影响提供了有价值的体外模型。该研究还纳入了临床数据分析。研究团队重点关注胃肠道活检中磷酸化RIP1表达与组织损伤之间的相关性，以及其在急性GVHD患者非复发死亡率中的预测价值。

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主要结果

Results

RIP1的激活与人肠道活检中的GVHD损伤有关，并与患者的长期预后有关

研究证明了RIP1的激活与人类肠道活检中的GVHD损伤之间存在相关性，并且还与患者的长期预后有关。作者具体地量化了接受HCT的患者胃肠道活检样本中的RIP1磷酸化（pRIP1），使用了一个先前建立的四点量表。研究结果揭示了RIP1磷酸化与GVHD引起的肠道损伤之间的强烈相关性。重要的是，这种相关性延伸到患者的长期预后，因为RIP1磷酸化与非复发死亡率增加有关。

图1 在胃肠道活检中，RIP1磷酸化与组织学损伤和长期预后相关。(A)对24例HCT后出现胃肠道症状的患者所采集的胃肠道活检样本进行pRIP1（Ser166）的免疫组织化学染色。(B)在分类为无/轻度（0/1）或中度/显著（2/3）的胃肠道活检样本中，绘制pRIP1丰度的小提琴图，并关联由Lerner评分评估的损伤严重程度。(C)绘制pRIP1丰度的ROC曲线和活检后的12个月非复发死亡率。(D)根据pRIP1丰度绘制非复发死亡率的累积发病率。

RIP1的失活能够挽救人和小鼠的肠道类器官免于凋亡

作者从肠道组织中建立了类器官，并让它们暴露于患有胃肠道GVHD的患者的血清中，这些血清中含有高浓度的干扰素-γ（IFN-γ）和TNFα。向培养基中添加单个血清样本显著降低了类器官活力，而添加RIP1抑制剂GNE684可以逆转这一现象。同时添加IFN-γ和TNFα会导致类器官活力的大量丧失，而GNE684也可以逆转这一影响。作者还发现，当将凋亡拮抗剂birininapant与TNFα一起添加到人类结肠类器官中时，GNE684可以逆转RIP1的磷酸化。

图2 RIP1的失活可防止人类类器官中的细胞凋亡。(A)GVHD患者血清中的IFN-γ和TNFα浓度。(B-E)从健康人建立类器官并在含有指示添加剂的培养基中培养。(B)在添加来自具有无胃肠道GVHD证据的个体（GVHD-）或具有胃肠道GVHD症状的个体（GVHD+）的血清72小时后，肠道类器官的存活率。(C)如B中所述，对结肠类器官进行处理。(DE)肠道和结肠类器官在含有指示添加剂的培养基中的存活率。(F)在培养基中含有指示添加剂的人结肠类器官中，通过免疫组织化学法评估pRIP1。

在小鼠中使RIP1失活可以预防胃肠道GVHD，并降低HCT后死亡率

作者使用经过良好表征的急性GVHD小鼠模型，分析了野生型（WT）和RIP1激酶死亡（KD）受体在同种和异种HCT中的胃肠道。结果显示，与WT受体相比，RIP1 KD受体中切割的caspase 3减少，粘膜固有层淋巴细胞分泌的促炎细胞因子减少，肠道长度增加。重要的是，GVHD引起的死亡率在RIP1 KD小鼠中显著降低，这表明遗传性RIP1失活对GI GVHD诱导的死亡率具有保护作用。

图3 在转基因小鼠中，RIP1的失活可防止细胞凋亡。从小鼠建立类器官并在含有指示添加剂的培养基中培养。(A)来自同种异体移植小鼠（空心条）或异体移植小鼠（实心条）的血清被添加到小鼠肠道类器官中，并按材料和方法所述定量细胞活力。(B)随着IFN-γ和TNFα浓度的增加，测定细胞活力。(C)从小鼠肠道类器官中分离Lgr5+干细胞并测定细胞活力。(D)从小鼠肠道类器官中分离出Lgr5+干细胞并对其进行培养和评估细胞活力。(E)从小鼠肠道类器官中分离出Lgr5+干细胞并进行培养和评估细胞活力。(F)从小鼠肠道类器官中分离出Lgr5+干细胞并进行培养和评估细胞活力。

图4 在HCT受体小鼠中，RIP1的基因失活可以预防GI GVHD并降低死亡率。B6 WT和B6-RIP1 KD小鼠接受了来自同种异体或异体C3H.SW供体的HCT。在小肠移植后第9天收获并分析小肠，进行Western blot和lamina propria淋巴细胞的流式细胞术分析。(A)来自各个小鼠的空肠的Western blot，用于检测RIP1、RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL、caspase 8、caspase 3和actin。(B)通过密度测定法测量的裂解的caspase 3与全长（FL）caspase 3的比率。(C)和(D)分别对CD4+和CD8+群体中的IFN-γ+和TNFα+进行定量。(E)在移植后第9天测量肠道长度。(F)和(G)分别显示B6 WT受体和B6-RIP1 KD受体从C3H.SW供体和同种异体B6 WT供体移植后的生存情况。

通过药物抑制RIP1可以预防小鼠的胃肠道GVHD并提高生存率

作者使用急性GVHD小鼠模型，从HCT当天开始每天给B6野生型小鼠进行腹腔注射GNE684或安慰剂。结果显示，GNE684处理显著减少了粘膜固有层中的白细胞亚群数量，包括T淋巴细胞、效应CD4+T细胞、效应CD8+T细胞、Treg、巨噬细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞。重要的是，GNE684治疗还改善了来自同种和异种供体的小鼠的生存结局。

图5 (A-D) B6 WT小鼠接受了与图4相同的HCT，并从HCT后第0天开始每日进行腹腔注射，注射GNE684 75 mg/kg（蓝条）或等量溶剂（红条）。(A)在第9天处理小肠，并通过流式细胞术分析计算同种异体或异体HCT后小肠系膜中白细胞亚群的数量。细胞亚群包括以下几种：T淋巴细胞（CD3+）、效应CD4+T细胞（CD4+IFN-γ+和CD4+TNFα+）、效应CD8+T细胞（CD8+IFN-γ+和CD8+TNFα+）、Treg（CD4+Foxp3+）、常规T细胞（CD4+Foxp3−）、调节/常规CD4+T细胞比率（Foxp3+/Foxp3−）、巨噬细胞（F4/80+）、自然杀伤细胞（NK1.1+）和中性粒细胞（Ly6G+）。(B)通过流式细胞术定量Lgr5-eGFP受体小鼠中的ISC。(C)从小肠的近端空肠到盲肠取出小肠，并测量其长度。(D)从小肠隐窝中分离出类器官，并在添加了指示添加剂的培养基中培养，5天后测量其活力。(E)B6 WT小鼠接受了HCT，来自同种异体B6 WT供体或异体C3H.SW供体，并在从HCT后第0天开始的14天内接受了不同剂量的GNE684。(F)HCT受体来自同种异体B6 WT供体或异体Balb/c供体，从HCT后第0天开始接受14天的每日注射，注射溶剂或GNE684。(G)HCT受体来自同种异体B6 WT供体或异体C3H.SW供体，从HCT后第7天开始的14天的每日注射。注射的物质包括溶剂或GNE684。

RIP1的抑制可以改善小鼠在GVHD期间的免疫重建

GNE684处理不仅减少了GVHD目标器官中的炎症浸润，而且逆转了GVHD期间肠道和肝脏中调节性T细胞（Treg）的显著减少。此外，GNE684治疗减少了脾脏T细胞的耗竭，从而改善了免疫重建。作者推测，RIP1激酶抑制对Treg的作用是间接的，可能与逆转肠道菌群失调有关，这可以减少GVHD并诱导Treg的扩增。

图6 通过药理学抑制RIP1的GNE684可以防止小鼠肝脏中炎症细胞浸润的积累。小鼠接受了HCT并进行了与图4相同的处理。肝脏在9天时被取出并处理，炎症细胞亚群的数量通过流式细胞术进行分析和计算。细胞亚群包括以下几种：T淋巴细胞（CD3+）、效应CD4+T细胞（CD4+IFN-γ+和CD4+TNFα+）、效应CD8+T细胞（CD8+IFN-γ+和CD8+TNFα+）、Treg（CD4+Foxp3+）、常规T细胞（CD4+Foxp3−）、调节/常规CD4+T细胞比率（Foxp3+/Foxp3−）、巨噬细胞（F4/80+）、自然杀伤细胞（NK1.1+）和中性粒细胞（Ly6G+）。

图7 通过药理学抑制RIP1的GNE684并不抑制淋巴细胞功能，而是在小鼠GVHD期间改善免疫重建。(A)从B6 WT天然小鼠分离的T细胞用CFSE染色并在体外用抗CD3/CD28珠进行刺激，同时或不同时加入GNE684，刺激5天后（左），然后与PMA刺激4小时以检测细胞内TNFα和IFN-γ（橙色条）或仅TNFα（绿色条）（右）。(BC) B6 WT小鼠接受了同种异体供体的HCT，并接受了每日75mg/kg的Vehicle或GNE684治疗14天，并在第14天收获器官。(B)通过流式细胞术定量了胸腺中的CD4+、CD8+、CD4+CD8+和CD4−CD8−的绝对数量。(C)从脾脏中分离CD3+ T细胞并定量（左），染色并刺激5天的CFSE，然后收获细胞并用PMA刺激4小时以通过流式细胞术检测细胞内IFN-γ和TNFα（右）。(D) B6 WT小鼠接受了同种异体或异体C3H.SW供体的HCT，并接受了每日75mg/kg的Vehicle或GNE684治疗。在第14天时分离脾细胞，并通过流式细胞术分析了CD4+和CD8+ T细胞亚群上的PD-1和TIM-3的细胞表面表达（左和中间）。从脾细胞中分离CD3+ T细胞，染色并用CFSE，在体外用Balb/c DCs刺激5天，然后分析了CD4+和CD8+细胞表面表达（右）。

在小鼠中，抑制RIP1可以保护GVL效应

使用与B6受体小鼠同源的淋巴瘤和骨髓瘤模型，研究了RIP1抑制对GVL效应的影响。结果显示，通过药理学和遗传学方法抑制RIP1可以改善长期生存率，同时不会损害淋巴细胞和骨髓白血病小鼠模型中的GVL效应。这表明，RIP1抑制可能代表一种非免疫抑制性的GVHD治疗方法，可以保留有益的GVL效应，这对于消除移植后的恶性肿瘤至关重要。

图8 RIP1抑制在实验小鼠中保护了GVL效应。实验小鼠接受HCT，方法同图4。向每个受体的供体接种物中添加C1498（AC）或EL-4（BD）白血病细胞。（AB）白血病致死（左）和生存（右）的B6 WT受体（红色）和B6-RIP1 KD HCT受体（紫色），从同种异体供体或从异体C3H.SW供体进行移植。（CD）注射了14天的实验小鼠，通过腹腔内注射给予Vehicle或GNE684；然后接受HCT，来自同种异体B6 WT供体和来自异体C3H.SW供体。

总结

这项研究调查了RIP1抑制在GVHD和GVL效应中的角色，该研究在接受HCT的小鼠中进行。研究发现，基因和药理学上抑制RIP1均能有效预防GVHD的胃肠症状，改善生存结果，并在急性GVHD的小鼠模型中保留GVL效应。此外，RIP1抑制与GVHD目标器官中免疫重建增强和炎症浸润减少相关，同时不影响GVL效应。这些结果表明，RIP1抑制可能为管理HCT后的GVHD提供一种非免疫抑制的治疗方法，通过降低与GVHD相关的死亡率来改善患者预后，同时保留有益的GVL效应。该研究为RIP1抑制作为提高HCT在白血病患者中的安全性和有效性的策略提供了有价值的见解。

参考信息

Inhibition of RIP1 improves immune reconstitution and reduces GVHD mortality while preserving graft-versus-leukemia effects.Sci Transl Med. 2023 Dec 20;15(727):eadf8366. doi: 10.1126/scitranslmed.adf8366.PMID: 38117900.

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来源：培养盒守护者